Способ получения 2-хлор-2′-дезоксиаденозина

( 12 19/40, 12 119) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявители Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Михайлопуло Игорь Александрович Калиниченко Елена Николаевна Зинченко Анатолий Иванович Барай Владимир Николаевич Ерошевская Людмила Анатольевна(73) Патентообладатели Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Способ получения 2-хлор-2-дезоксиаденозина путем ферментативного воздействия на смесь 2-хлораденина и 2-дезоксигуанозина в фосфатном буфере биокатализатора,представляющего собой стабилизированные глутаровым альдегидом клетки бактерий, отличающийся тем, что процесс ведут при 63-67 , концентрации 2-хлораденина и 2 дезоксигуанозина в исходной реакционной смеси соответственно 40-80 мМ и 120-240 мМ и концентрации биокатализатора 0,05-0,2 мас. , и после окончания основного цикла процесса проводят повторный цикл, используя отделенные от целевого продукта биокатализатор и не прореагировавшие субстраты. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве клеток бактерий используют,предпочтительно, клеткиБМ-21 илиБМТ-1 Д/1 А. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что процесс ведут при рН 7,3-7,8.(56)., 1993. - . 12. - . 417-422.... - 1992. - . 14. -8. - . 669.1705347 1, 1992.1500675 1, 1989. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментативным способам получения 2-хлор-2-дезоксиаденозина (ХДА) - одного из самых эффективных препаратов,применяющихся для терапии разнообразных лимфопролеферативных патологий 1, 2. Кроме того, ХДА в настоящее время рассматривается в качестве перспективного средства для лечения хронического рассеянного склероза 3. 5602 1 Таким образом, изобретение может быть использовано для получения активной субстанции при производстве соответствующих лекарственных препаратов. Известен химический способ получения ХДА 4, который заключается в конденсации 2,6-дихлорпурина с 1-хлор-2-дезокси-3,5-ди-О-п-толуилэритро-пентофуранозой с последующим деблокированием полупродукта путем аммонолиза. Хроматография на силикагеле с последующей кристаллизацией из этанола позволяет получать целевой продукт с выходом 41,9 мол.в расчете на исходный 2,6-дихлорпурин. Недостатками химического способа получения ХДА являются 1. Применение в качестве донора 2-дезоксирибозного фрагмента труднодоступного модифицированного производного 2-дезоксирибозы. 2. Не технологичность стадии аммонолиза полупродукта, заключающейся в обработке его при 100 С жидким аммиаком в безводном метаноле в течение 5 час. 3. Сложность выделения ХДА из реакционной смеси из-за образующегося в результате реакции побочного неактивного стереоизомера. 4. Сравнительно низкий выход целевого продукта, что обусловлено недостаточной специфичностью химического процесса гликозилирования исходного гетероцикла. Известен способ получения ХДА 5, заключающийся в замене тимина в молекуле 2-дезокситимидина на 2-хлораденин под действием фермента трансдезоксирибозилазы,выделенной из клеток. Процесс ведут при 37 С в течение 2-4 суток. Выход ХДА, изолированного из реакционной смеси путем ионообменной хроматографии, составляет 40 мол.в расчете на исходный 2-хлораденин и 25 мол.в расчете на 2-дезокситимидин. Данные по производительности реактора авторами не приведены. Недостатками указанного способа являются 1. Малая доступность и высокая стоимость очищенного фермента. 2. Длительность (2-4 суток) процесса трансгликозилирования 2-хлораденина. 3. Невысокий (40 мол. ) выход ХДА, что обусловлено низкой конверсией исходного 2-хлораденина используемым ферментом. Известен также способ получения ХДА 6, предусматривающий инкубирование 2-хлораденозина (5 мМ) с 2-дезоксиаденозином (30 мМ) в присутствии клеток-5275 в течение 5 час при 37 С. Выход изолированного ХДА, согласно указанному способу, составляет 56 мол.в расчете на исходный донор 2-хлораденина и 9,3 мол.в расчете на 2-дезоксиаденозин. Недостатками рассматриваемого способа являются 1. Сравнительно невысокий выход целевого продукта, составляющий 56 мол.в расчете на введенный в реакцию 2-хлораденозин и 9,3 мол.в расчете на исходный 2 дезоксинуклеозид, что обусловлено низкой активностью используемого биокатализатора. 2. Малая доступность используемого 2-хлораденозина, получение которого требует проведения сложного многоступенчатого синтеза. 3. Необходимость в обработке конечной реакционной смеси аденозиндезаминазой (из селезенки крупного рогатого скота) для дезаминирования не прореагировавших аденозина и 2-дезоксиаденозина, затрудняющих выделение целевого продукта из смеси. Известен способ получения ХДА 7, заключающийся в том, что 2-хлораденин химически трансформируют в 2-хлор-6-диметиламинометилен-аденин, который затем ферментативно 2-дезоксирибозилируют, используя 2-дезоксиуридин в качестве донора пентозы и клетки Е.-, иммобилизованные в альгинатном геле, в качестве биокатализатора. После снятия диметиламинометиленовой защиты у полученного полупродукта аммонолизом получают целевой продукт с выходом 50,3 мол.в расчете на 2-хлораденин и 33,5 мол.в расчете на исходный 2-дезоксиуридин. Недостатками указанного способа являются 2 5602 1 1. Необходимость модификации 2-хлораденина для устранения его дезаминирования биокатализатором в условиях реакции 2-дезоксирибозилирования. 2. Низкий выход целевого продукта - 50,3 мол.в расчете на исходный 2-хлораденин и 33,5 мол.в расчете на исходный 2-дезоксиуридин. 3. Использование в качестве донора пентозы малодоступного 2-дезоксиуридина, получение которого требует проведения процесса дезаминирования природного нуклеозида 2-дезоксицитидина. 4. Высокий расход биокатализатора, составляющий 2,2 мг сырых клеток/мг продукта. 5. Низкая производительность единицы объема реактора - 5,7 мг продукта/мл. Из известных способов получения ХДА наиболее близким к предлагаемому способу(прототипом) является способ получения ХДА 8, заключающийся в том, что 2-хлораденин в присутствии 2-дезоксигуанозина и катализатора - клеток Е.БМТ-1 Д/1 А, стабилизированных глутаровым альдегидом, трансформируется в ХДА. Выход целевого продукта после выделения из реакционной смеси составляет 59 мол.в расчете на исходный 2-хлораденин и 19,7 мол.в расчете на исходный 2-дезоксигуанозин. Недостатками способа-прототипа являются 1. Сравнительно низкий выход целевого продукта, составляющий 59 мол.в расчете на взятый в реакцию 2-хлораденин и 19,7 мол.в расчете на исходный 2-дезоксигуанозин. Это обусловлено низкой эффективностью стадии ферментативной трансформации 2-хлораденина в его 2-дезоксирибозид, что, в свою очередь, объясняется сравнительно низкой активностью клеток в случае данного варианта трансгликозилирования. 2. Высокий расход биокатализатора, составляющий 0,23 мг клеток/мг продукта, и низкая производительность единицы объема реактора (0,85 мг продукта/мл), что ограничивает возможность применения рассматриваемого способа в условиях промышленного производства. Главным недостатком всех известных ферментативных способов получения ХДА является сравнительно невысокий выход целевого продукта, что обусловлено обратимостью,лежащей в основе процесса реакции трансгликозилирования, катализируемой пуриннуклеозидфосфорилазами. В известных способах для повышения выхода ХДА (в расчете на наиболее дорогостоящий субстрат - 2-хлораденин) в реакционную смесь вносят избыточное (обычно 3-кратное) количество второго субстрата (нуклеозида - донора дезоксирибозного остатка),что способствует сдвигу равновесия процесса в сторону образования целевого продукта.(Использование более высоких соотношений концентраций донора и акцептора дезоксирибозы приводит к нерациональному расходованию 2-дезоксинуклеозида). Задачей предполагаемого изобретения является способ получения ХДА, обеспечивающий повышение выхода ХДА, повышение производительности реактора и сокращение расхода биокатализатора. Поставленная задача решается заявляемым способом получения ХДА , заключающимся в воздействии биокатализатора на основе стабилизированных глутаровым альдегидом клеток бактерий, предпочтительнона смесь 2-хлораденинаи 2-дезоксигуанозинав фосфатном буфере при 63-67 С, причем концентрация 2-хлораденинав исходной смеси составляет 40-80 мМ, а 2-дезоксигуанозина -120-240 мМ. После окончания основного процесса синтеза ХДА , характеризующегося прекращением прироста целевого продукта в реакционной смеси, биокатализатор и большую часть не прореагировавших субстратов отделяют от целевого продукта и используют для проведения повторного цикла процесса. Целевой продукт выделяют из растворов, полученных после основного и повторного циклов, известными приемами. Заявляемый способ описывается следующим уравнением реакции 3 В качестве биокатализатора используют стабилизированные глутаровым альдегидом клетки бактерий, предпочтительно клетки, в частностиБМ-21 илиБМТ-1 Д/1 А. ШтаммБМ-21 депонирован в Коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси под коллекционным номером БИМ В-200 Д. Предпочтительной является 0,05-0,2 -ная концентрация биокатализатора. Процесс ведут в фосфатном буфере (рН 7,3-7,8) в связи с тем, что фермент пуриннуклеозидфосфорилаза, под действием которой происходит замещение гуанина в молекуле 2-дезоксигуанозина на 2-хлораденин с образованием ХДА, проявляет активность только в присутствии фосфат-ионов. В заявляемом способе поставленная задача решается путем проведения повторного цикла (рециклинга) синтеза ХДА, используя отделенные от целевого продукта биокатализатор и не вступившие в реакцию субстраты, при обязательном соблюдении двух условий а) проведение процесса при 63-67 С, т.е. при температуре, превышающей ранее считавшуюся оптимальной б) использование субстратов в реакционной смеси в концентрациях в несколько раз(от 4 до 12) превышающих использовавшиеся ранее при сохранении обычного (31 в пользу донора дезоксирибозы) их молярного соотношения. При этом подъем температуры выше оптимальной для проявления ферментом своей активности, в принципе, должен был бы снизить выход продукта или увеличить продолжительность процесса, однако в реальных условиях синтеза ХДА, благодаря ощутимому увеличению растворимости 2-хлораденина (или, другими словами, увеличению действующей концентрации его в растворе), значительно повышает эффективность работы фермента и способствует сдвигу равновесия реакции в сторону синтеза целевого продукта. Без внесения в реакционную смесь избыточных (по сравнению с использованными в способах-аналогах) количеств субстратов не удается путем охлаждения эффективно осадить 2-дезоксигуанозин и, таким образом, отделить его вместе с 2-хлораденином и биокатализатором от целевого продукта перед дополнительным циклом синтеза ХДА. Таким образом, только сочетание указанных выше признаков способа приводит к решению поставленной задачи. Нижеприведенные примеры конкретного осуществления иллюстрируют заявленный способ, не ограничивая объема изобретения. Пример 1. Получения ХДА в оптимальных условиях проведения процесса. Реакционную смесь (80 мл), содержащую 813,9 мг 2-хлораденина (4,8 ммоль), 3848 мг 2-дезоксигуанозина (14,4 ммоль), 10 мМ К-фосфатный буфер (рН 7,5) и 80 мг (в расчете на сухую массу) биокатализатора, инкубируют 5 час при 65 С с перемешиванием. За приростом количества целевого продукта в смеси следят с помощью тонкослойной хроматографии. После прекращения прироста ХДА в реакционной смеси ее выдерживают 16-18 час на холоду. Выпавший осадок, содержащий не прореагировавшие субстраты и биокатализатор, собирают на стеклянном фильтре и промывают водой. Промывку объединяют с фильтратом. 4 5602 1 Осадок с фильтра суспендируют в 30 мл 10 мМ К-фосфатного буфера (рН 7,5) и процесс синтеза ХДА повторяют снова, инкубируя полученную реакционную смесь при 65 С. После остановки реакции кипячением (3 мин) реакционную смесь осветляют центрифугированием (5 мин, 10000 ). Осадок суспендируют в 10 мл воды и повторно центрифугируют в том же режиме. Обе надосадочные жидкости объединяют с фильтратом,полученным при проведении основного процесса синтеза ХДА, и наносят на колонку(2,610 см) со смолой 18 в ОНформе. Смолу промывают 100 мл воды и ХДА элюируют 70 -ным этанолом. Фракции, содержащие ХДА, объединяют и упаривают на роторном испарителе при 40-50 С до сиропообразной массы. К остатку дважды прибавляют по 20 мл этанола с последующим упариванием досуха. После перекристаллизации из 50 -ного этанола и высушивания кристаллов в темноте при комнатной температуре получают 1234 мг хроматографически чистого ХДА, что составляет 90 мол.в расчете на взятый в реакцию 2-хлораденин и 30 мол.в расчете на взятый в реакцию 2-дезоксигуанозин. При хроматографировании на тонкослойных пластинках -254 фирмы(Германия) в системе растворителей бутанол 25 -ный водный аммиак (72 об/об) подвижность целевого продукта совпадала сконтрольного препарата ХДА. Т. пл. целевого продукта 215-220 С (с почернением). УФ-спектр в 0,05 М К-фосфатном буфере (рН 7), макс нм 265 (15200). Элементный состав для 101253 М 285,70. Вычислено,С 42,03 Н 4,2424,52 С 1 12,41. Найдено,С 42,05 Н 4,2524,48 С 1 12,36. Пример 2. Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что процесс ведут при 63 С и концентрациях 2-хлораденина и 2-дезоксигуанозина в исходной реакционной смеси, равных 40 и 120 мМ, соответственно. После выделения из реакционной смеси получают 1168 мг (85,2 мол. ) ХДА. Пример 3. Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что процесс ведут при 67 С и концентрациях 2-хлораденина и 2-дезоксигуанозина в исходной реакционной смеси, равных 80 и 240 мМ, соответственно. После выделения из реакционной смеси получают 1191 мг (86,9 мол. ) ХДА. Пример 4. Получение ХДА при использовании биокатализатора на основе клеток различных микроорганизмов. Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что в качестве биокатализатора используют клетки различных штаммов микроорганизмов. Достигнутые выходы реакции синтеза ХДА (без выделения целевого продукта) представлены в табл. 1. Таблица 1 Сравнительная оценка эффективности наиболее активных штаммов микроорганизмов Относительная Штамм микроорганизмов Выход ХДА, мол.эффективность,БМ-21 97 100 Е. со БМТ-1 Д/1 А 90 92 Е.-3110 78 80 5602 1 Пример 5. Получение ХДА при использовании различных концентраций биокатализатора в реакционной смеси. Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что процесс ведут при различных концентрациях биокатализатора в реакционной смеси. Достигнутые выходы целевого продукта представлены в табл. 2. Таблица 2 Влияние концентрации биокатализатора в реакционной среде на выход целевого продукта. Концентрация биокатализатора Продолжительность Выход ХДА, мол.в реакционной среде,процесса, час 0,05 87 13 0,1 89 7 0,2 90 4 Из приведенных выше примеров следует, что положительный эффект достигается в случае вариантов, характеризующихся сочетанием следующих параметров проведения процесса а) температура реакции - 63-67 С б) концентрация 2-хлораденина 40-80 мМ(соответственно концентрация 2-дезоксигуанозина 120-240 мМ) с) рециклинг (проведение процесса в две стадии). Использование предлагаемого способа получения ХДА обеспечивает по сравнению с известными решениями преимущество в виде увеличения выхода целевого продукта в расчете на исходный 2-хлораденин с 59 до 85-90 мол. , а также повышение производительности биореактора с 0,85 до 14,6-15,4 мг продукта/мл полезного объема и снижение расхода биокатализатора с 0,23 до 0,05-0,09 мг/мг продукта. Источники информации 1. Пивник А.В., Кременецкая , Яхнина Е.И., Романова М.И., Воробьев А.И. Первый опыт лечения зрелоклеточных лимфопролиферативных заболеваний аналогами пурина//Проблемы гематологии и переливания крови. - 1996. -2. - . 55-62. 2.., 2-//.. - 1996. - . 38.2. - . 93-101. 3..,,,,.,.//. . . . . - 1996. . 93. -4. - . 1716-1720. 4..,,,2-, 2-,2-//. . . . - 1984. - . 106. -21. - . 6379-6382. 5..,.,,,2 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.