Способ получения регенеранта сортовой голубики высокой Vaccinium corymbosum L.

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТА СОРТОВОЙ ГОЛУБИКИ ВЫСОКОЙ.(71) Заявители Учреждение образования Полесский государственный университет Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Кудряшова Оксана Александровна Волотович Антон Анатольевич Герасимович Татьяна Васильевна Беда Ирина Олеговна Хрипач Владимир Александрович(73) Патентообладатели Учреждение образования Полесский государственный университет Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ получения регенеранта сортовой голубики высокой.,заключающийся в том, что высаживают эксплант, состоящий не менее чем из двух метамеров, на питательную среду с 4,8-5,0 следующего состава, мг/л среды аммоний азотнокислый 400,00 калий сернокислый 990,00 магний сернокислый семиводный 370,00 калий фосфорнокислый однозамещенный 170,00 кальций азотнокислый 400,00 кальция хлорид 82,80 марганец сернокислый одноводный 16,90 цинк сернокислый семиводный 8,60 медь сернокислая пятиводная 0,25 борная кислота 6,20 натрий молибденовокислый двухводный 0,25 железосернокислое семиводное 27,80 трилон Б 37,30 тиамина хлорид 1,00 пиридоксина хлорид 0,50 никотиновая кислота 0,50 глицин 2,00 мезоинозитол 100,00 аденина сульфат 80,00 18710 1 2014.10.30 6-(,-диметилаллиламино)пурин 2,00 индолилуксусная кислота 0,50-1,00 24-эпибрассинолид 0,05-0,15 сахароза 30000,00 агар-агар 8000,00 вода деионизированная остальное. и инкубируют в течение 8 недель при освещенности 6000 лк/м 2, фотопериоде 16 ч день, 8 ч ночь, температуре 25 С и относительной влажности воздуха 70 . Изобретение относится к сфере биотехнологии, к области клеточных технологий в растениеводстве, к направлению клонального микроразмножения растений. Область применения изобретения биотехнология, сельское и лесное хозяйство, пищевая и медицинская промышленность. Согласно прототипу 1, клональное микроразмножение регенерантов сортовой голубики высокой.осуществляется на питательной, агаризованной среде 2, 3, содержащей в своем составе аммоний азотнокислый, калий сернокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций азотнокислый, кальция хлорид, марганец сернокислый, цинк сернокислый, медь сернокислую, борную кислоту, натрий молибденовокислый, железосернокислое, трилон Б,тиамина хлорид, пиридоксина хлорид, никотиновую кислоту, глицин, мезоинозитол, аденина сульфат, 6-(,-диметилаллиламино)пурин, индолилуксусную кислоту, сахарозу,агар-агар. Недостатком указанной среды для размножениярегенерантов сортовой голубики высокой является высокий - 5,0 мг/л (при соотношении цитокининауксин 51) расход дорогостоящего цитокинина 6-(,-диметилаллиламино)пурина, что приводит к удорожанию размножаемогопосадочного материала сортовой голубики высокой. Задача изобретения заключается в модификации состава питательной, агаризованной среды для размножениярегенерантов сортовой голубики высокой с целью одновременного уменьшения расхода 6-(,-диметилаллиламино)пурина и существенного увеличения коэффициентов размножения регенерантов, т.е. увеличения количества формируемых у регенеранта побегов и увеличения количества получаемых из регенеранта полноценных эксплантов, каждый из которых состоит не менее чем из двух метамеров. Задача решается тем, что в процессе приготовления питательной агаризованной среды используется 24-эпибрассинолид и высадка размножаемыхэксплантов сортовой голубики высокой осуществляется на модифицированную питательную, агаризованную среду, содержащую аммоний азотнокислый, калий сернокислый, магний сернокислый,калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций азотнокислый, кальция хлорид, марганец сернокислый, цинк сернокислый, медь сернокислую, борную кислоту, натрий молибденовокислый, железосернокислое, трилон Б, тиамина хлорид, пиридоксина хлорид,никотиновую кислоту, глицин, мезоинозитол, аденина сульфат, 6-(,-диметилаллиламино)пурин, индолилуксусную кислоту, сахарозу, агар-агар, дополненную 24-эпибрассинолидом, при следующем соотношении компонентов в мг/л аммоний азотнокислый 400,00 калий сернокислый 990,00 магний сернокислый семиводный 370,00 калий фосфорнокислый однозамещенный 170,00 кальций азотнокислый 400,00 кальция хлорид 82,80 марганец сернокислый одноводный 16,90 цинк сернокислый семиводный 8,60 2 18710 1 2014.10.30 медь сернокислую пятиводную борная кислота натрий молибденовокислый двухводный железосернокислое семиводное трилон Б тиамина хлорид пиридоксина хлорид никотиновая кислота глицин мезоинозитол аденина сульфат 6-(,-диметилаллиламино)пурин индолилуксусная кислота 24-эпибрассинолид Сахароза агар-агар вода деионизированная Кислотность питательной среды 4,8-5,0. Модифицированная нами питательная, агаризованная среда (при соотношениях цитокининауксин 21 или 41) позволяет увеличить в 1,18-1,58 раз количество формируемых у регенеранта побегов и увеличить в 1,62-1,98 раз количество получаемых из регенеранта эксплантов, каждый из которых состоит не менее чем из двух метамеров. Пример. Исследования проводили на базе биотехнологической лаборатории НИЛ клеточных технологий в растениеводстве УО Полесский государственный университет. В качестве объекта исследований использовали размножаемыерегенеранты позднеспелого сортаголубики высокой .. в количестве не менее 80 регенерантов для каждого варианта опыта, в четырехкратной повторности. Регенеранты получали в результате культивирования эксплантов (состоящих из двух метамеров) в колбах конических (объемом по 100 мл) с 25 мл стерильной агаризованной,питательной среды на микро-, макросолевой основе 2, 3 из расчета 20 эксплантов/колбу. Варианты опыта различались только по фитогормональному составу агаризованной, питательной среды 1. Контроль 5,00 мг/л 6-(,-диметилаллиламино)пурина и 1,00 мг/л индолилуксусной кислоты (соотношение цитокининауксин 51). 2. 2,00 мг/л 6-(,-диметилаллиламино)пурина и 1,00 мг/л индолилуксусной кислоты(соотношение цитокининауксин 41), 0,15 мг/л 24-эпибрассинолида. Вариант 1 - регенеранты культивируют на стандартной питательной, агаризованной среде, содержащей в мг/л аммоний азотнокислый 400,00 калий сернокислый 990,00 магний сернокислый семиводный 370,00 калий фосфорнокислый однозамещенный 170,00 3 18710 1 2014.10.30 кальций азотнокислый кальция хлорид марганец сернокислый одноводный цинк сернокислый семиводный медь сернокислую пятиводную борную кислоту натрий молибденовокислый двухводный железосернокислое семиводное трилон Б тиамина хлорид пиридоксина хлорид никотиновую кислоту глицин мезоинозитол аденина сульфат 6-(,-диметилаллиламино)пурин индолилуксусную кислоту сахарозу агар-агар воду деионизированную Кислотность питательной среды 4,8-5,0. Вариант 2 - регенеранты культивируют на модифицированной питательной, агаризованной среде, содержащей в мг/л аммоний азотнокислый 400,00 калий сернокислый 990,00 магний сернокислый семиводный 370,00 калий фосфорнокислый однозамещенный 170,00 кальций азотнокислый 400,00 кальция хлорид 82,80 марганец сернокислый одноводный 16,90 цинк сернокислый семиводный 8,60 медь сернокислую пятиводную 0,25 борную кислоту 6,20 натрий молибденовокислый двухводный 0,25 железосернокислое семиводное 27,80 трилон Б 37,30 тиамина хлорид 1,00 пиридоксина хлорид 0,50 никотиновую кислоту 0,50 глицин 2,00 мезоинозитол 100,00 аденина сульфат 80,00 24-эпибрассинолид 0,05 6-(,-диметилаллиламино)пурин 2,00 индолилуксусную кислоту 1,00 ахарозу 30000,00 агар-агар 8000,00 воду деионизированную остальное. Кислотность питательной среды 4,8-5,0. 4 18710 1 2014.10.30 Вариант 3 - регенеранты культивируют на модифицированной питательной, агаризованной среде, содержащей в мг/л аммоний азотнокислый 400,00 калий сернокислый 990,00 магний сернокислый семиводный 370,00 калий фосфорнокислый однозамещенный 170,00 кальций азотнокислый 400,00 кальция хлорид 82,80 марганец сернокислый одноводный 16,90 цинк сернокислый семиводный 8,60 медь сернокислую пятиводную 0,25 борную кислоту 6,20 натрий молибденовокислый двухводный 0,25 железосернокислое семиводное 27,80 трилон Б 37,30 тиамина хлорид 1,00 пиридоксина хлорид 0,50 никотиновая кислота 0,50 глицин 2,00 мезоинозитол 100,00 аденина сульфат 80,00 24-эпибрассинолид 0,15 6-(,-диметилаллиламино)пурин 2,00 индолилуксусную кислоту 1,00 сахарозу 30000,00 агар-агар 8000,00 воду деионизированную остальное. Кислотность питательной среды 4,8-5,0. Вариант 4 - регенераты культивируют на модифицированной питательной, агаризованной среде, содержащей в мг/л аммоний азотнокислый 400,00 калий сернокислый 990,00 магний сернокислый семиводный 370,00 калий фосфорнокислый однозамещенный 170,00 кальций азотнокислый 400,00 кальция хлорид 82,80 марганец сернокислый одноводный 16,90 цинк сернокислый семиводный 8,60 медь сернокислую пятиводную 0,25 борную кислоту 6,20 натрий молибденовокислый двухводный 0,25 железосернокислое семиводное 27,80 трилон Б 37,30 тиамина хлорид 1,00 пиридоксина хлорид 0,50 никотиновую кислоту 0,50 глицин 2,00 мезоинозитол 100,00 аденина сульфат 80,00 24-эпибрассинолид 0,05 5 18710 1 2014.10.30 6-(,-диметилаллиламино)пурин 2,00 индолилуксусную кислоту 0,50 сахарозу 30000,00 агар-агар 8000,00 воду деионизированную остальное. Кислотность питательной среды 4,8-5,0. Вариант 5 - регенераты культивируют на модифицированной питательной, агаризованной среде, содержащей в мг/л аммоний азотнокислый 400,00 калий сернокислый 990,00 магний сернокислый семиводный 370,00 калий фосфорнокислый однозамещенный 170,00 кальций азотнокислый 400,00 кальция хлорид 82,80 марганец сернокислый одноводный 16,90 цинк сернокислый семиводный 8,60 медь сернокислую пятиводную 0,25 борную кислоту 6,20 натрий молибденовокислый двухводный 0,25 железосернокислое семиводное 27,80 трилон Б 37,30 тиамина хлорид 1,00 пиридоксина хлорид 0,50 никотиновую кислоту 0,50 глицин 2,00 мезоинозитол 100,00 аденина сульфат 80,00 24-эпибрассинолид 0,15 6-(,-диметилаллиламино)пурин 2,00 индолилуксусную кислоту 0,50 сахарозу 30000,00 агар-агар 8000,00 воду деионизированную остальное. Кислотность питательной среды 4,8-5,0. Через 8 недель культивирования на стеллажах световой установки культурального помещения биотехнологической лаборатории при температуре 25 С, фотопериоде 16 ч день, 8 ч ночь, освещенности 6000 лк/м 2 (4 люминесцентных лампы 36/76), относительной влажности воздуха 70 учитывали количество побегов у каждого регенеранта и рассчитывали коэффициенты размножения (как количество сформированных побегов из одного экспланта - КРП и как количество полноценных эксплантов, состоящих не менее чем из двух метамеров каждый, получаемое из одного сформированного регенеранта - КРЭ). Общий математический анализ данных проводили по стандартным методам вариационной статистики 4 с использованием программы статистического анализа данных 6.0. Результаты исследований сведены в таблицу. 18710 1 2014.10.30 Изменчивость коэффициентов размножения у регенерантов сортаголубики высокойВариант опыта 25,00 ИУК 1,00 (контроль) 22,00 ИУК 1,00 ЭБ 0,05 22,00 ИУК 1,00 ЭБ 0,15 22,00 ИУК 0,50 ЭБ 0,05 22,00 ИУК 0,50 ЭБ 0,15 НСР 0,05 НСР 0,01 Примечание НСР - наименьшая существенная разница при 0,05 и 0,01 соответственно фитогормоны 2 - 6-(,-диметилаллиламино)пурин ЭБ - 24-эпибрассинолид ИУК - индолилуксусная кислота- достоверно отличается от контроля при 0,01. Источники информации 1. Сидорович Е.А., Кутас Е.Н. Клональное микроразмножение новых плодово-ягодных растений. - Минск Навукатэхнка, 1996. - С. 121-124 (прототип). 2.,. - /,. - 1999-2000. - 454 . 3. Решетников В.Н. и др. Некоторые аспекты микроклонального размножения голубики высокой и брусники обыкновенной // Плодоводство. - 2007. - Т. 19. - С. 209-216. 4. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. - М. Агропромиздат, 1985. - 351 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7