Способ получения растения-регенеранта адониса весеннего Adonis vernalis L.

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Кутас Елена Николаевна Огородник Любовь Евгеньевна Малахова Ирина Николаевна Горецкая Анастасия Антоновна Кухарева Лидия Васильевна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси(57) Способ получения растения-регенеранта адониса весеннего., заключающийся в том, что подготавливают эксплант, представляющий собой почку возобновления адониса весеннего, при этом отбирают почку возобновления с растения адониса весеннего, промывают ее проточной водой и слабым раствором марганцевокислого калия и стерилизуют в 0,1 -ном растворе азотнокислого серебра в течение 5-8 мин, после чего культивируют подготовленный эксплант в стерильных условиях до образования регенеранта на питательной среде с 6,0, имеющей следующий состав компонентов,мг/л 0,83 262 0,025 4 72 557 2 ЭДТА 745 мезоинозит 100 глицин 2 тиамин 1 пиридоксин 1 никотиновая кислота 1 кинетин 2,5 сахароза 30 000 индолилуксусная кислота 2,5 поливинилпирролидон 10 000 агар 9 000,причем культивирование экспланта адониса весеннего осуществляют при флуоресцентном освещении 4000 лк с фотопериодом 16 ч при температуре 24 С и влажности воздуха 70 . Изобретение относится к сфере клонального микроразмножения растений. Область применения интродукция, охрана окружающей среды (сохранение биоразнообразия растений), народная медицина. Известно, что. (горицвет весенний) является ценным лекарственным растением. Заготовка травы горицвета весеннего привела к истощению растительных ресурсов этого вида. В связи с этим горицвет весенний занесен в Красную книгу и подлежит охране 1. Известно, что горицвет весенний в силу своих биологических особенностей плохо размножается традиционными методами - вегетативным и генеративным. Альтернативным методом традиционному размножению может служить регенерация горицвета весеннего. В доступной нам литературе отсутствуют положительные экспериментальные данные получения регенерантов горицвета весеннего в культуре 2. Для решения поставленной задачи предложен способ получения регенерантов горицвета весеннего в условиях стерильной культуры ( ). Сущность способа получения регенерантов адониса весеннего (.) в условияхзаключается в приготовлении модифицированной питательной среды для выращивания почек возобновления и регенерантов адониса весеннего, выборе растения в естественных условиях для отбора почек возобновления, предварительной промывке их в проточной воде, затем в слабом растворе марганцевокислого калия, подготовке растительного материала (эксплантов) путем стерилизации почек возобновления адониса весеннего в 0,1 -ном растворе азотнокислого серебра с предварительным погружением в 70-градусный этанол с последующей трехкратной промывкой в стерильной дистиллиро 2 18208 1 2014.06.30 ванной воде, посадке стерильных эксплантов (почек возобновления) в колбы одинакового объема на модифицированную питательную среду для культивирования почек возобновления, высаживании почек возобновления на модифицированную питательную среду для культивирования регенерантов и культивировании их под флуоресцентным освещением до образования вегетативных и генеративных побегов. Для осуществления способа получения регенерантов адониса весеннего требуется определенный набор оборудования, посуды, инструментов, сырья и реактивов. Используемое оборудование включает ламинар-бокс, автоклав, весы лабораторные, дистиллятор,бидистиллятор, -метр, стеклянные цилиндры градуированные 25, 50 мл, стеклянные стаканы градуированные с носиком 50 и 1000 мл, водяную баню, пипет-дозаторы на 200 мкл, пипет-дозаторы на 1000 мкл, конические колбы объемом 100 мл, стерильные скальпели, стерильные пинцеты, стерильные стеклянные чашки Петри диаметром 9 см,стеклянные палочки, спиртовку, алюминиевую фольгу. Используемое сырье и реактивы включают почки возобновления и почки обогащения адониса весеннего, воду дистиллированную, воду бидистиллированную, маточные растворы макросолей (табл. 1), микросолей (табл. 2) и хелата железа (табл. 3), модифицированную среду для культивирования почек возобновления (табл. 4) и регенерантов (табл. 5) адониса весеннего, этанол, азотнокислое серебро. Затем проводят подготовку оборудования, приготовление питательной среды и ее автоклавирование, подготовку растительного материала (эксплантов), стерилизацию почек возобновления адониса весеннего, посадку эксплантов адониса на модифицированную питательную среду, культивирование почек возобновления адониса весеннего (эксплантов) на модифицированной питательной среде до получения вегетативных и генеративных побегов. Способ получения регенерантов адониса весеннего (.) включает приготовление питательной среды путем использования маточных растворов макро- и микросолей, хелата железа, витаминов по Уайту, мезоинозита, тиамина-, пиридоксина-,никотиновой кислоты, поливинилпирролидона, глицина, ИУК, кинетина, сахарозы, агара,этанола, азотнокислого серебра присреды 6,0. Схема получения регенерантов адониса весеннего представлена на фигуре. В результате экспериментальных исследований по изучению морфогенеза и регенерации адониса весеннего разработаны различные модификации питательных сред, обеспечивающие получение регенерантов адониса весеннего в условиях. Приводим разработанные нами составы маточных растворов макросолей, микросолей и хелата железа, составы модифицированных питательных сред для культивирования почек возобновления и регенерантов. Таблица 1 Маточный раствор макросолей 18208 1 2014.06.30 Таблица 2 Маточный раствор микросолей Содержание в 1 л пи- Содержание в 100 мл бидистиллиКомпонент среды тательной среды, мг рованной воды, мг 242 2 0,25 25 452 0,025 2,5 33 6,2 620 452 24,1 2410 или 44 Н 2 О 22,3 2230 5 472 8,6 860 6 0,83 83 7 262 0,025 2,5 Таблица 3 Маточный раствор хелата-железапп. Компонент среды Количество вещества мг на 100 мл бидистиллята 1 472 557 2 2 ЭДТА 745 Таблица 4 Модифицированная среда для культивирования почек возобновления адониса весеннего Компоненты среды Концентрация компонентов (мл/л) среды Макросоли (маточный раствор) 50 Микросоли (маточный раствор) 1 Хелат железа (маточный раствор) 5 Витамины по Уайту 1 Мезоинозит 100 мг Глицин 2 мг ИУК 2,5 мг Кинетин 2,5 мг Поливинилпирролидон 10 000 мг Сахароза 30 000 мг Агар 9 000 мг 6 Таблица 5 Модифицированная среда для культивирования регенерантов адониса весеннего Компоненты среды Концентрация компонентов (мл/л) среды Макросоли (маточный раствор) 50 Микросоли (маточный раствор) 1 Хелат железа (маточный раствор) 5 Витамины по Уайту 1 Мезоинозит 100 мг Глицин 2 мг ПУК 1 мг Кинетин 3 мг Поливинилпирролидон 10 000 мг Сахароза 30 000 мг Агар 9 000 мг 18208 1 2014.06.30 Для осуществления способа получения регенерантов адониса весеннего необходимо провести тщательную подготовку посуды и инструментов. С этой целью колбы, чашки Петри, мерные цилиндры, стаканы моют с использованием стирального порошка, ополаскивают 12 раз проточной водой и 2 раза дистиллированной. Сухую чистую посуду используют для приготовления маточных растворов и питательной среды. Инструменты(пинцеты, скальпели) заворачивают в термостойкую бумагу и стерилизуют сухим жаром при температуре 180 С на протяжении 2 ч. Стерильные инструменты помещают в ламинар-бокс. Приготовление питательной среды и ее автоклавирование производят в соответствии с прописью модифицированной питательной среды, представленной в табл. 4, взвешивают,растворяют и приливают все необходимые компоненты в мерный стакан объемом 1 л, доводятсреды до 6,0, разливают содержимое в колбы, закрывают фольгой и автоклавируют при давлении 0,75 атм. в течение 25 мин. Застывшую среду помещают в ламинарбокс. Подготовку растительного материала (эксплантов) начинают осенью с выбора растения адониса весеннего. Для этого визуально выбирают растение адониса весеннего без видимых повреждений и отмечают его этикеткой. Весной в марте-апреле, как только сойдет снежный покров, отбирают почки возобновления адониса весеннего. Предварительно их промывают в проточной воде, затем в слабом растворе марганцевокислого калия. Стерилизация почек возобновления адониса весеннего проводят в 0,1 -ном растворе азотнокислого серебра в течение 8 мин (крупные), 5-6 мин (мелкие) (с предварительным погружением в 70-градусный этанол на 5 с), с последующей трехкратной промывкой в стерильной дистиллированной воде в течение 5, 10 и 15 мин, соответственно. Стерильные экспланты помещают в колбы одинакового объема по 20 мл модифицированной питательной среды в каждой (состав питательной среды в табл. 4). Перед посадкой и окончанием посадки почек горлышко каждой колбы и фольгу обжигают над пламенем спиртовки. Эту же процедуру выполняют и с инструментами. Культивируют почки возобновления, высаженные на модифицированную питательную среду для получения регенерантов, под флуоресцентным освещением с фотопериодом 16 ч, освещенностью 4000 лк при температуре 24 С и влажности воздуха 70 . Из каждой почки образовалось по 2 побега вегетативный и генеративный. Нами разработаны нормы расхода сырья и материалов, необходимых для получения стерильной культуры и регенерантов, которые приводим в табл. 6. Таблица 6 Нормы расхода сырья и вспомогательных материалов при получении стерильной культуры и регенерантов адониса весеннегопп. Наименование материалов, сырья Расход на одну посадку 1 Почки возобновления адониса весеннего, шт 50 2 3, мг 1900 3 43, мг 1650 4 472, мг/ 4 безводный 370/180 5 242, мг/ 2 мг 440/332,5 6 24, мг 170 7 452, мг/ 442, мг 24,10/22,30 8 472, мг 8,6 9 33, мг 6,2 10 Продолжение таблицы 6 Расход на одну посадку 55,7 74,5 100 1,00 1,00 1,00 10 000 30 000 2 2,5/1 2,5/3 9000 250 100 Источники информации 1. Парень М.И. Адонис весенний (.) в Украине (еколого-ценотичн особенности и охрана) Дис.канд. биол. наук 03.00.05 / Национальный ботанический сад им. М.М. Гришка НАН Украины. - К., 2002. - С. 166-185. 2. Мокшин Е.В., Лукатин А.С. Изучение способности. к морфогенезу в культуре. В сб. Междунар. конф. Биология клеток растенийи биотехнология. Звенигород, 8-12 сентября. - М., 2008. - С. 264. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6