Способ получения иммуностимулирующего препарата

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Гусев Анатолий Алексеевич Новикова Оксана Николаевна Ломако Юрий Васильевич(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(57) Способ получения иммуностимулирующего препарата, при котором в водный раствор хлорида натрия добавляют тритерпеновые сапонины, полученный раствор стерилизуют при 100 С в течение 5-7 мин, охлаждают до 30-35 С, добавляют формальдегид в виде 3740 -ного раствора, доводятдо значения 5,0-7,0, затем раствор перемешивают при температуре 10-40 С при скорости мешалки 100-150 об/мин в течение 10-20 мин до получения раствора однородного цвета со следующим соотношением компонентов, мас.натрия хлорид 0,80-0,85 тритерпеновые сапонины 0,03-0,05 формальдегид 0,05-0,07 дистиллированная вода остальное. Изобретение относится к области ветеринарии, может быть использовано в качестве иммуностимулирующего средства для неспецифической профилактики факторных заболеваний инфекционной этиологии, например колибактериоза свиней и телят. Известен способ получения иммуностимулирующего препарата, описанный в заявке на изобретение Иммуностимулирующий препарат, который заключается в смешивании активного начала - формальдегида с физиологическим раствором натрия хлорида на основе дистиллированной воды, причем в качестве активного начало он содержит формальдегид 0,07-0,24 , а в качестве целевых добавок содержит натрия хлорид - 0,9-0,95 дистиллированную воду - остальное до 100 . Препарат используют в качестве стимулятора естественной резистентности, восстанавливающего иммунный статус организма и обеспечивающего иммунологическую перестройку в отношении опухолевых клеток, воз 18395 1 2014.08.30 будителей инфекционных заболеваний, антигенов и гаптенов при заболеваниях не выясненной этиологии 1. Недостатком этого способа является получение иммуностимулирующего препарата со сравнительно низкой фармакологической активностью. Задачей заявляемого изобретения является разработка способа, позволяющего получить иммуностимулирующий препарат с расширенным спектром фармакологической активности, обладающего иммуностимулирующим и адаптивным действием. Поставленная задача достигается с помощью использования способа, при котором в водный раствор хлорида натрия добавляют тритерпеновые сапонины, полученный раствор стерилизуют при 100 С в течение 5-7 мин, охлаждают до 30-35 С, добавляют формальдегид в виде 37-40 -ного раствора, доводятдо значения 5,0-7,0, затем раствор перемешивают при температуре 10-40 С при скорости мешалки 100-150 об/мин в течение 1020 мин до получения раствора однородного цвета со следующим соотношением компонентов, мас.натрия хлорид 0,80-0,85 тритерпеновые сапонины 0,03-0,05 формальдегид 0,05-0,07 дистиллированная вода остальное. Кроме того, поставленная задача достигается за счет того, что иммуностимулирующий препарат дополнительно содержит тритерпеновые сапонины, которые при взаимодействии с холестерином клетки формируют поры в двойных слоях мембраны клетки, в результате чего повышается биологическая доступность молекул формальдегида, которые при проникновении в клетку модулируют внутриклеточные процессы метаболизма 2,т.е., наблюдается новое свойство заявляемого препарата в результате синергитического эффекта. Кроме того, поставленная задача достигается за счет применения отработанных мас.соотношений заявляемых компонентов, которое выражается в снижении эффективности применения заявляемого препарата при уменьшении заявленных соотношений мас. , а при увеличении заявленных соотношений мас.появляется отрицательный эффект в виде гемолитического эффекта - разрушение эритроцитов (табл. 1, 3, 4, 5). Таблица 1 Изучение гематологических показателей у поросят при курсовом введении иммуностимулирующего препарата Доза препаГемоглоГруппа жирата,Эритроциты,Тромбоци- Лейкоциты,Гематокрит бин,вотных мл/10 кг 1012/л ты, 109/л 109/л ммоль/л массы тела Препарат 1,0 4,30,8 0,250,03 8,31,6 367,869,4 11,22,5 Препарат 2,0 3,60,6 0,200,05 7,60,9 355,873,1 12,93,1 Препарат 3,0 3,240,4 0,190,03 6,41,2 327,884,5 10,22,7 Без обраКонтроль 4,50,5 0,290,04 8,51,5 322,853,2 12,83,2 ботки Примечание- при 0,05,- при 0,01. Тритерпеновые сапонины - высокомолекулярные сложные органические соединения гликозидного характера, растворяются в воде с образованием коллоидных растворов,уменьшают величину поверхностного натяжения и, подобно мылу, образуют пену, способствуют повышению проникающей способности клеточных мембран 3, 4. Кроме того, для тритерпеновых сапонинов характерно адаптогенное, антиоксидантное, противовоспалительное, противоопухолевое действие 4. Формальдегид - первый представитель класса альдегидов . Представляет собой бесцветный газ с резким запахом, мол. массой 30,03, плотность его при 20 С равна 0,815,2 18395 1 2014.08.30 температура плавления 92 С температура кипения 19,2 С. Хорошо растворим в воде,спирте. В чистом виде легко полимеризуется, образуя параформальдегид, и используется в качестве биологического модулятора обменных процессов в клетке 2, 5. Натрия хлорид - кубические кристаллы или белый кристаллический порошок соленого вкуса, без запаха. Растворим в воде (13). Используется в качестве образующего компонента для физиологического раствора 6. Дистиллированная вода - 2, бесцветная прозрачная жидкость без запаха и вкуса,используется в качестве растворителя 7. Пример 1. Способ получения иммуностимулирующего препарата. Способ получения иммуностимулирующего препарата, при котором в водный раствор хлорида натрия добавляют тритерпеновые сапонины, полученный раствор стерилизуют при 100 С в течение 5-7 мин, охлаждают до 30-35 С, добавляют формальдегид в виде 3740 -ного раствора, доводятдо значения 5,0-7,0, затем раствор перемешивают при температуре 10-40 С при скорости мешалки 100-150 об/мин в течение 10-20 мин до получения раствора однородного цвета со следующим соотношением компонентов, мас.натрия хлорид 0,80-0,85 тритерпеновые сапонины 0,03-0,05 формальдегид 0,05-0,07 дистиллированная вода остальное. Стабильность физико-химических свойств иммуностимулирующего препарата изучали с использованием метода ускоренного старения путем повышения температуры хранения препарата на 15 С 8. Результаты изучения стабильности заявляемого препарата представлены в табл. 2. Таблица 2 Результаты изучения органолептических, физико-химических и биологических показателей иммуностимулирующего препарата в зависимости от показателя концентрации водородных ионов раствора Показатель концентрации водородных ионов , единицы Наименование показателя Характеристика и норма 4,0 5,0-7,0 8,0 прозрачная бесцветная или светло-соломенного цвета,опалесцирующая жидкость без осадка и без запаха, при 1. Внешний вид, цвет, запах,не соотне соотвстряхивании которой насоответналичие осадка и механичеветствуветствует,блюдается пенообразоваствует ских примесей ет, садок осадок ние. Допускается наличие механических примесей в 3 от общего количества флаконов в партии должен выдерживать испы 2. Стерильность стерилен стерилен стерилен тание 3. Массовая доля тритерпе 0,03-0,05 0,030 0,030 0,030 новых сапонинов,4. Подлинность содержания должен выдерживать испы- выдервыдер- выдержитритерпеновых сапонинов тание живает живает вает 5. Подлинность содержания должен выдерживать испыформальдегида тание 3 Продолжение таблицы 2 Показатель концентрации водородных ионов , единицы препарат не должен вызывать гибель и признаки заболеваний у клинически нетокси- нетокси- нетоксиздоровых белых мышей при чен чен чен его однократном введении под кожу в объеме 0,30 см 3 Пример 2. Применения иммуностимулирующего препарата, приготовленного заявляемым способом, для профилактики факторных заболеваний инфекционной этиологии, например колибактериоза поросят и телят. Иммуностимулирующий препарат используют для профилактики факторных заболеваний инфекционной этиологии, например колибактериоза поросят и телят. Испытание иммуностимулирующего препарата проводили в хозяйствах, неблагополучных по колибактериозу. Диагноз на колибактериоз поставлен на основании заключения бактериальной экспертизы. С профилактической целью иммуностимулирующий препарат вводили телятам и поросятам в 20-дневном возрасте телятам в объеме - 2,0, 3,0, 4,0 мл, а поросятам - 0,5, 1,0,2,0 мл один раз в сутки с интервалом 24 ч двукратно, с повторным введением через 7-10 суток по аналогичной схеме. Контрольная группа - интактные животные. Таблица 3 Перевод объемных единиц препарата (мл) в весовые единицы (г) Количество активнодействующих веществ, г Объем препарата, мл Тритерпеновые сапонины Формальдегид-4 3,0 11,010 21,010-4 4,0 14,010-4 28,010-4 Полученные результаты по эффективности применения иммуностимулирующего препарата, приготовленного заявляемым способом, с целью профилактики колибактериоза у телят и поросят представлены в табл. 4, 5. Таблица 4 Эффективность профилактического применения иммуностимулирующего препарата, приготовленного заявляемым способом, на телятах ВыздоровеГруппа живот- Кол-во животных Препарат,Заболело Пало ло ных в группе мл/теленок Телята (голов, ) 1. Опытная 30 2,0 7 23,3 6 85,7 1 3,3 2. Опытная 30 3,0 5 16,6 5 100 0 0 3. Опытная 30 4,0 8 26,6 6 75 2 6,6 4. Контрольная 30 17 56,6 9 52,9 8 26,6 4 18395 1 2014.08.30 Таблица 5 Эффективность профилактического применения иммуностимулирующего препарата, приготовленного заявляемым способом, на поросятах Кол-во живот- Препарат,Заболело Выздоровело Пало Группа животных ных в группе мл/поросенок Поросята (голов, ) 1. Опытная 20 0,5 5 25 4 80 1 5 2. Опытная 20 1,0 3 15 3 100 0 0 3. Опытная 20 2,0 7 35 5 71,4 2 10 4. Контрольная 20 11 55 6 54,5 5 25 Как видно из данных, представленных в табл. 4 и 5, эффективность применения иммуностимулирующего препарата с целью профилактики колибактериоза зависит от дозы введения. При применении препарата на телятах наиболее эффективной была доза 3,0 мл/теленок. Наилучший результат у поросят отмечали при введении препарата в дозе 1,0 мл/поросенок. Таким образом, иммуностимулирующий препарат при применении его для профилактики факторных заболеваний инфекционной этиологии, в частности колибактериоза, у поросят и телят позволяет снизить заболеваемость этой бактериальной инфекцией соответственно на 25-26,6 . При изучении неспецифических гуморальных и клеточных факторов иммунитета было выявлено, что иммуностимулирующий препарат повышал бактерицидную и лизоцимную активность сыворотки крови и стимулировал фагоцитарную активность гранулоцитов(табл. 6-8). Таблица 6 Изучение бактерицидной активности сыворотки крови поросят Бактерицидная активность сыворотки крови,До начала введения препарата 7 сутки после введения препарата 1. Опыт 33,53,1 44,53,8 2. Прототип 36,44,5 38,23,3 Контроль 35,94,2 34,64,1 Примечание- при 0,05. Таблица 7 Изучение лизоцимной активности сыворотки крови поросят Группа животных Лизоцимная активность сыворотки крови,До начала введения препарата 7 сутки после введения препарата 1. Опыт 1,910,2 2,80,2 2. Прототип 1,950,1 2,470,4 Контроль 2,180,4 2,790,6 Примечание- при 0,01. Таблица 8 Изучение фагоцитарной активности гранулоцитов крови поросят Группа животных Фагоцитарный показатель,До начала введения препарата 7 сутки после введения препарата 1. Опыт 65,63,7 78,64,3 2. Прототип 69,34,3 79,55,3 Контроль 72,75,8 74,94,9 Примечание- при 0,05. Группа животных 18395 1 2014.08.30 В табл. 9, 10 представлены сравнительные результаты по изучению эффективности применения иммуностимулирующего препарата в дозе 1,0 мл/поросенок (1) по указанной выше схеме и базового препарата (прототип) (2) в условиях технологического стресса (перегруппировки поросят и перевода их в 30-дневном возрасте в группу доращивания). Таблица 9 Изучение эффективности иммуностимулирующего препарата в качестве адаптогена применения Группа животных 1. Опыт 2. Прототип Контроль Заболело Выздоровело Пало Поросята (голов, ) 2 13,3 2 100 0 0 7 46,6 5 71,4 2 28,5 6 60,0 4 66,6 2 33,3 Как видно из представленных в табл. 9 данных, иммуностимулирующий препарат обладает выраженным адаптогенным действием, повышая устойчивость поросят к неблагоприятным факторам технологического стресса. Изучение основных биохимических маркеров стресса в крови поросят через 7 дней после их перевода в группу доращивания показало, что в опытной группе (1) достоверно не изменялся уровень общего белка, холестерина, а также активность ферментов аспартатаминотрансферазы (АсАт) и аланинаминотрансферазы (АлАт). В тоже время во 2-й группе (прототип) и у контрольных поросят отмечали достоверное (0,01) снижение уровня общего белка и холестерина, при этом активность АсАт и АлАт повышалась. Таблица 10 Изучение основных биохимических маркеров стресса в крови поросят при применении иммуностимулирующего препарата ПерегрупБиохимические показатели Группа жипировка поХолестерин,вотных Общий белок, г АлАт, ед/л АсАт, ед/л росят ммоль/л до 71,41,49 1,80,16 32,91,6 22,91,6 1. Опыт после 69,81,62 1,70,2 33,82,8 23,81,8 до 72,71,56 1,90,12 34,51,7 21,51,7 2. Прототип после 65,21,32 1,50,11 46,93,5 25,91,5 до 75,41,44 1,80,1 30,41,2 22,41,2 Контроль после 66,41,29 1,40,1 44,91,9 27,91,9 Примечание- при 0,01. Разработан способ, позволяющий получить иммуностимулирующий препарат с расширенным спектром фармакологической активности, обладающий иммуностимулирующим и адаптивным действием в отличии от прототипа. Источники информации 1. Патент 2077882 1, МПК 661 31/115, 9/08, 1997 (прототип). 2. Формалин Электронный ресурс. 2011. Режим доступа //.///00/00/0000042/017 Дата доступа 2.11.2011. 3. Сапонины Электронный ресурс. 2011. Режим доступа //////. Дата доступа 2.11.2011. 6 18395 1 2014.08.30 4. Сапонины Электронный ресурс. 2011. Режим доступа //отд.//САпонины. Дата доступа 2.11.2011. 5. Формалин Электронный ресурс. 2011. Режим доступа ////Формальдегид. Дата доступа 2.11.2011. 6. Хлорид натрия Электронный ресурс. 2011. Режим доступа ////Хлорид натрия. Дата доступа 2.11.2011. 7. Вода дистиллированная - ГОСТ 6709-72. 8. Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственного средства на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре. - М., 1974. - 9 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7