Пробиотический препарат для молодняка сельскохозяйственных животных или цыплят-бройлеров

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ МОЛОДНЯКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ ИЛИ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Головнева Наталья Алексеевна Самарцев Андрей Анатольевич Рябая Наталья Евгеньевна Найденко Инна Александровна Щетко Виталий Анатольевич Денисенко Вера Витальевна Каврус Михаил Аркадьевич Михалюк Александр Николаевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56) Методические указания по применению пробиотических препаратов на основе метаболитов лакто- и бифидобактерий для сельскохозяйственных животных и птиц. - Минск, 2009. С. 17-24. КРАСОЧКО П.А. и др. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины, 2007. - Т. 43. Вып. 1. С. 123-124. РЯБАЯ Н.Е. и др. Ветеринарная наука производству. Материалы международной научно-практической конференции. Научные труды. Вып. 38. Минск, 2005. - С. 448-449.2091075 1, 1997.2253672 2, 2005.2264456 1, 2005.2193059 2, 2002.(57) Пробиотический препарат для молодняка сельскохозяйственных животных или цыплят-бройлеров в жидкой или лиофилизированной форме, содержащий в жидкой форме около 5109 КОЕ/мл, а в лиофилизированной около 11010 КОЕ/г совместно культивированных клеток штаммаБИМ В-375 Д иБИМ В-492 Д, объемное соотношение которых в посевном материале составляло соответственно 31. Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии, ветеринарии и может быть использовано для получения пробиотического препарата с лечебно-профилактическими свойствами для отраслей животноводства и птицеводства. В настоящее время отмечается тенденция ко все более широкому использованию для лечения и профилактики нарушений микроэкологии желудочно-кишечного тракта и нормализации его деятельности не только у человека, но и у сельскохозяйственных животных и птицы пробиотических препаратов (или пробиотиков), получаемых с использованием различных штаммов бифидобактерий и молочнокислых микроорганизмов - основных 17073 1 2013.04.30 представителей нормальной микрофлоры животных и человека. В состав препаратов для коррекции и нормализации микрофлоры включаются и представители других родов микроорганизмов. Разработка и применение этих препаратов обоснованы многочисленными доказательствами позитивного влияния этих микроорганизмов и продуктов их метаболизма на макроорганизм. Использование подобных препаратов, в отличие от применяемых с аналогичной целью антибиотиков, является экологически безопасным и часто более эффективным, а в последующем не сказывается негативным образом на потребительских свойствах продукции сельскохозяйственного животноводства и птицеводства 1-5. Известен жидкий пробиотический препарат, получаемый путем раздельного культивирования трех микроорганизмов ( ,и) и последующего смешивания культуральных жидкостей в определенном соотношении 6. В результате получают пробиотический препарат, эффективный в профилактике и лечении животных и птицы и увеличивающий конверсию корма с высоким содержанием клетчатки. Однако микроорганизмы видав составе препарата не являются нормальными представителями нормофлоры желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных, а относятся, скорее, к транзиторным видам 7. Кроме того, препарат получают в течение 4-6 суток, что, с точки зрения современного производства, экономически неэффективно. Недостатками являются также необходимость приготовления двух различных питательных многокомпонентных сред, использование двух различных температурных режимов для культивирования, что тоже приводит к усложнению всего технологического процесса и повышает затраты. После раздельного культивирования осуществляют смешивание суспензий микроорганизмов. Наиболее близким к заявляемому изобретению является пробиотик лактомикроцикол,используемый для выращивания и откорма бройлерной птицы 8. Пробиотик содержит штамми штамм. К недостаткам излагаемого способа получения пробиотика можно отнести использование штамма Е. , отличающегося чувствительностью к значительному спектру антибактериальных препаратов, что может существенно ограничить возможности применения заявляемого пробиотика при одновременном использовании антибактериальных агентов. Штамм лактобактерий в составе пробиотика обладает широким спектром антагонистической активности, однако продуцируемые им соединения способны подавлять и представителей своего же рода. К недостаткам изобретения также можно отнести необходимость раздельного культивирования микроорганизмов, входящих в состав пробиотика, что подразумевает использование различных питательных сред и усложняет технологический процесс. Недостатком является необходимость раздельного хранения составных частей пробиотика (при условии его применения в жидкой форме) и смешивания непосредственно перед использованием, что может свидетельствовать о неблагоприятном взаимном влиянии используемых культур микроорганизмов друг на друга. Позитивный эффект действия пробиотика показан только с использованием цыплят-бройлеров. Целью изобретения является новый пробиотический препарат для выращивания и откорма молодняка сельскохозяйственных животных или цыплят-бройлеров, расширяющий ассортимент пробиотиков, используемых в сельском хозяйстве, и способный восстановить уровень нормофлоры кишечника, повысить набор живой массы животными благодаря содержанию в высоких количествах жизнеспособных клеток бифидо- и лактобактерий,устойчивых к неблагоприятным факторам желудочно-кишечного тракта, имеющих широкий спектр антагонистической и антимикробной активности, обладающих высокими скоростью роста и уровнем накопления жизнеспособных клеток, эффективно нормализующих биоценоз желудочно-кишечного тракта и улучшающих обмен веществ у молодняка сельскохозяйственных животных и птицы. 17073 1 2013.04.30 Поставленная цель достигается тем, что в качестве пробиотика для молодняка сельскохозяйственных животных или цыплят-бройлеров заявляется препарат, основой которого являются штамм бифидобактерий .БИМ В-375 Д и штамм молочнокислых бактерий .БИМ В-492 Д, взятые в соотношении 31. Соотношение бифидо- и лактобактерий 31 было установлено экспериментальным путем и является оптимальным для максимального накопления жизнеспособных клеток микроорганизмов в процессе культивирования. Пробиотик может быть получен в жидкой и сухой формах. Уровень жизнеспособных клеток микроорганизмов в жидком пробиотическом препарате около 5109 в 1 мл, в сухом -около 1109 в 1 г. Штамм .БИМ В-375 Д получен длительной направленной селекцией по уровню протеолитической активности на питательных средах с различными субстратами белковой природы в присутствии повышенных концентраций желчи. Штамм отличается высокой скоростью роста на различных питательных средах для культивирования бифидобактерий и уровнем накопления жизнеспособных клеток не менее 1109 в 1 мл. Способен расти в интервале температур 27-39 С и диапазоне 5,0-7,2. Оптимальная температура роста 37,50,5 . При выращивании в жидких питательных средах растет по всей высоте объема за исключением поверхностной зоны аэробиоза в 0,5-1 см. Штамм желчеустойчив (сохраняет рост в присутствии 1 желчи) и кислотоустойчив (сохраняет жизнеспособность при 2,5 в течение 60 минут). Клетки грамположительные, неподвижные, спор не образуют. Палисадный тип расположения клеток в мазке, короткие прямые и полиморфные разветвленные палочки с булавовидными утолщениями на концах. Штамм антагонистически активен в отношении патогенных представителей вида, родов , , , . Устойчив к норсульфазолу, гентамицину, канамицину, нетромицину, фортуму, амфотерицину, стрептомицину, левомицетину. Штамм непатогенный, нетоксигенный. Штамм депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов. Штамм .БИМ В-492 Д выделен из силосной массы овсяницы тростниковой. Штамм отличается высокой скоростью роста на различных питательных средах для культивирования молочнокислых бактерий и уровнем накопления жизнеспособных клеток не менее 5109 в 1 мл. Способен расти в интервале температур 20-40 С и диапазоне 4,0-7,2. Оптимальная температура роста 300,5 С. При выращивании в жидких питательных средах растет по всей высоте объема за исключением поверхностной зоны аэробиоза в 0,5-1 см. Штамм желче- и кислотоустойчив. Растет в присутствии до 3 желчи в питательной среде. Сохраняет жизнеспособность при 2,0 в течение 60 минут. Штамм антагонистически активен в отношении патогенных представителей вида,родов , , , , , . Устойчив к стрептомицину, левомицетину, доксициклину, цефазолину. Штамм непатогенный, нетоксигенный. Штамм депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов. Штаммы характеризуются отсутствием антагонизма в отношении друг друга. Для получения заявляемого пробиотического препарата необходимы 1. Питательные среды для штаммов бифидо- и лактобактерий. Для бифидобактерий такими средами являются кукурузно-лактозная, гидролизатно-молочная, сывороточная и др. 9, для молочнокислых бактерий - среды МРС,и др. 10. Приготовленные питательные среды разливают в стерильные емкости и стерилизуют при избыточном давлении 0,75 атм в течение 30 мин. 2. Питательная среда для пробиотического препарата, основой которой являются побочные продукты переработки пищевого сырья - мясной бульон, молочная сыворотка, меласса свекловичная, а также в качестве основы может быть использован заменитель цельного молока (ТУ 590003834.001-2007). Питательную среду стерилизуют при избыточном давлении 0,5 атм в течение 30 мин. 3 17073 1 2013.04.30 Питательная среда на основе мясного бульона включает 10 мясного бульона, 0,1 лактозы, 0,01 агара, 0,01 цистеина (или 0,02 аскорбиновой кислоты) которые растворяют при нагревании в воде питьевой (до 100 ) соответствующей требованиям СанПиН 10-124 РБ. Среду стерилизуют, как описано выше. Питательную среду на основе молочной сыворотки получают, растворяя, как описано выше, в воде питьевой 3 молочной сыворотки, 0,1 лактозы, 0,01 агара, 0,01 цистеина (или 0,02 аскорбиновой кислоты). Среду стерилизуют, как описано выше. Питательную среду на основе мелассы свекловичной получают, растворяя, как описано выше, в воде питьевой 3 мелассы свекловичной, 0,1 дрожжевого экстракта, 0,01 агара, 0,01 цистеина (или 0,02 аскорбиновой кислоты). Среду стерилизуют, как описано выше. Питательную среду на основе заменителя цельного молока получают, растворяя, как описано выше, в воде питьевой 0,5 сухого заменителя цельного молока, 0,1 дрожжевого экстракта, 0,01 агара, 0,01 цистеина (или 0,02 аскорбиновой кислоты). Среду стерилизуют как описано выше. 3. Активные культуры штамма бифидобактерий .БИМ В-375 Д и штамма лактобактерий .БИМ В-492 Д. 4. Посевной материал бактерий для получения пробиотического препарата. Посевной материал представляет собой активные культуры штаммов молочнокислых и бифидобактерий (полученные при культивировании на соответствующих питательных средах и в соответствующих условиях), которые смешивают между собой в соотношении 13. 5. Соответствующие условия и оборудование для осуществления процессов стерилизации питательных сред, посуды, получения в стерильных условиях при определенной температуре активных культур бифидо- и лактобактерий и в конечном счете наработки пробиотического препарата в жидкой форме. 6. Соответствующие условия, реактивы и оборудование для осуществления процессов отделения биомассы микроорганизмов от культуральной жидкости с последующим высушиванием из замороженного состояния с целью получения пробиотического препарата в сухой форме. Пример 1. Получение пробиотического препарата в жидкой форме. 1. Для активизации штаммов, входящих в состав пробиотика, готовят стерильные питательные среды для культур бифидо- и лактобактерий. Для бифидобактерий такими средами являются кукурузно-лактозная, гидролизатно-молочная, сывороточная и др., для молочнокислых бактерий - среды МРС,и др. Приготовленные питательные среды разливают в стерильные емкости и стерилизуют при избыточном давлении 0,75 атм в течение 30 мин. После охлаждения полученных сред до температуры 36-38 С в них вносят посевной материал бифидо- лактобактерий. Количество вносимого посевного материала бактерий на данном этапе составляет 5-6 об. . Посевной материал представляет собой поддерживаемые в условиях микробиологической лаборатории в жизнеспособном состоянии путем периодических пересевов культуры В.БИМ В-375 Д и .БИМ В-492 Д на вышеназванных питательных средах. Среды с внесенным посевным материалом помещают в термостат с температурой 36-38 С, выдерживают в течение 18-20 ч и получают активные культуры микроорганизмов с количеством жизнеспособных клеток бифидо- и лактобактерий не менее 11010 в 1 мл. 2. Полученные активные культуры штаммов .БИМ В-375 Д и .БИМ В-492 Д смешивают между собой в объемном соотношении 31 и получают посевной материал для пробиотического препарата. 3. Готовят стерильную питательную среду для пробиотического препарата на основе мясного бульона, молочной сыворотки, мелассы свекловичной или заменителя цельного молока (ТУ 590003834.001-2007). Состав сред и условия их приготовления приведены 4 17073 1 2013.04.30 выше. Готовую стерильную питательную среду охлаждают до температуры 36-38 С и вносят в термостатируемый реактор для накопления биомассы микроорганизмов. Также в реактор вносят посевной материал для пробиотического препарата в объеме 6-8 от объема питательной среды для пробиотика. После чего при периодическом перемешивании каждые 3 ч при температуре 36-38 С осуществляют культивирование в течение 18-20 ч. При соблюдении этих условий количество жизнеспособных клеток по окончании культивирования достигает уровня около 5109 в 1 мл. Таким образом, получают пробиотический препарат в жидкой форме. Пример 2. Получение пробиотического препарата в сухой форме. 1. Стадии 1, 2, 3 проводят, как описано в примере 1. 2. Соблюдая стерильность, осуществляют отделение выросшей биомассы микроорганизмов в полученном жидком пробиотическом препарате от культуральной жидкости пробиотического препарата с использованием методов центрифугирования или фильтрования. 3. К сконцентрированной таким образом биомассе микроорганизмов добавляют защитную среду для лиофилизации (обезжиренное молоко с сахарозой или желатиносахарозная среда), тщательно перемешивают до гомогенного состояния, замораживают и осуществляют лиофилизацию. По окончании процесса сушки получают пробиотик в сухой форме с содержанием жизнеспособных микроорганизмов около 11010 КОЕ/мл. Оценка эффективности разработанного пробиотического препарата была проведена в производственных опытах с использованием молодняка сельскохозяйственных животных и птицы. Достоверно было установлено, что добавление в рацион новорожденным поросятам пробиотика в жидкой форме способствовало активизации эритропоэза, что связано с повышением усвоения железа и витаминов, а также активизацией обменных процессов в организме. Так, к 7-му дню жизни поросят уровень эритроцитов в опытных группах по сравнению с контролем был выше примерно на 21 . В опытах с новорожденными телятами было установлено увеличение уровня эритроцитов в опытной группе животных к 7-му дню примерно на 11,5 . Была также отмечена положительная динамика восстановления уровня нормофлоры новорожденных поросят и телят с диарейным синдромом при использовании разработанного пробиотического препарата (табл. 1, 2). Таблица 1 Титр жизнеспособных культур бифидобактерий и лактобактерий, выделенных из содержимого кишечника поросят Возраст животных, дней Микроорганизмы 1-2 6-7 14-15 21-22 Титр КОЕ/г опыт 2,5104 1,3108 2,9104 3,0109 Бифидобактерии контроль 2,0104 2,3105 2,0104 1,6107 5 9 опыт 2,010 1,910 1,8105 7,2108 Лактобактерии контроль 1,8105 1,4105 1,0105 3,8105- группа животных, дополнительно получавшая пробиотик, - группа животных, находившаяся на стандартном рационе. 17073 1 2013.04.30 Таблица 2 Титр жизнеспособных культур бифидобактерий и лактобактерий, выделенных из содержимого кишечника телят Возраст животных, дней Микроорганизмы 1-2 7-8 Титр КОЕ/г опыт 1,5103 2,2108 Бифидобактерии контроль 1,3103 1,8105 5 опыт 1,510 1,3109 Лактобактерии контроль 1,6104 9,2105- группа животных, дополнительно получавшая пробиотик, - группа животных, находившаяся на стандартном рационе. Важным показателем эффективности разрабатываемых пробиотических препаратов является их влияние на показатели эффективности усвоения кормов и набор живой массы животными. В опытах был использован пробиотический препарат в жидкой форме в рационе поросят и телят и в сухой форме в рационе цыплят бройлеров (табл. 3). Таблица 3 Эффективность применения пробиотика при выращивании сельскохозяйственных животных и птицы Поросята Телята Цыплята-бройлеры Показатель Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт Средняя масса одной головы в 1,03 кг(1) 1,01 кг(1) 29,33 кг(1) 29,17 кг(1) 160,2 г(2) 159,1 г(2) начале проверки Средняя масса одной головы в 3,90 кг(3) 4,22 кг(3) 38,19 кг 40,06 кг(4) 1980 г(5) 2140,0 г(5) конце проверки Среднесуточный 0,205 кг 0,229 кг 0,422 кг 0,519 кг 43,33 г 47,16 г прирост Средняя прибавка основной про 8,24,97,2 дукции- цыплята в возрасте 49 дней. Таким образом, предлагаемый пробиотический препарат отличается от известного использованием специально подобранных штамма бифидобактерийБИМ В-375 Д и штамма лактобактерийБИМ В-492 Д отсутствием необходимости раздельного хранения частей пробиотика перед применением использованием дешевых питательных сред на основе мелассы свекловичной и заменителя цельного молока эффективным восстановлением уровня нормофлоры кишечника молодняка сельскохозяйственных животных, увеличением среднесуточных приростов и прибавки основной продукции цыплят-бройлеров и молодняка сельскохозяйственных животных. 17073 1 2013.04.30 Источники информации 1. Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования. - М., 2002. - С. 63-64. 2. Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы. Материалы междунар. конф. - М., 2004. - С. 8.-10. 3. Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы. Материалы междунар. конф. - М., 2004. - С. 128-132. 4. Биотехнология состояние и перспективы развития. Материалы конгресса. - М.,2007. - С. 177. 5. Биотехнология состояние и перспективы развития. Материалы конгресса. - М,2007. - С. 329. 6.2268297 2, МПК 121/20,61 35/74, 2006. 7. Интизаров М.М. Микрофлора тела животных/Ветеринарная медицина Электронный ресурс - Режим доступа - ////58 - Дата доступа 08.12.2009. 8.2268925 2, МПК 12 1/20,61 35/74, 2006. 9. Самарцев А.А., Астапович Н.И., Новик Г.И.//Микробиология. - 1997. - Т. 66. -5.С. 635-639. 10. Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. - М. Наука, 1975. - С. 64. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7