Способ оценки токсичности промышленных отходов

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ПРОМЫШЛЕННЫХ ОТХОДОВ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(72) Авторы Дроздова Елена Валентиновна Застенская Ирина Алексеевна Вежновец Василий Васильевич(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(56) Дроздова Е.В. // Здоровье и окружающая среда Сборник научных трудов. 2007. - Вып. 10. - С. 728-737. ДУДЧИК Н.В. и др. Сахаровские чтения 2008 года Экологические проблемывека Материалы 8-й международной научной конференции. - Минск,2008. - С. 55. БУДКИНА Е.А. и др. // Здоровье и окружающая среда Сборник научных трудов. - 2005. - Вып. 6. - С. 15-20.2281495 1, 2006.2202619 2, 2003.1057532 , 1983. Дроздова Е.В. Актуальные проблемы медицины Сборник научных статей. Гомель, 2009. - Т. 2. - С. 31-34. ФР.1.39.2007.03222. Биологические методы контроля. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний //(57) Способ оценки токсичности промышленных отходов, при котором осуществляют экспонирование тест-культуры водных ракообразных, обладающей чувствительностью к референсному веществу дихромату калия на уровне ЭК 50-9678,0(70,985,8) мг/дм 3,ЭК 16-9625,5 мг/дм 3, ЭК 84-96230 мг/дм 3, водной вытяжкой из промышленных отходов без разведения и в диапазоне разведений от 110 до 11000000 в течение 96 часов при 16204 1 2012.08.30 температуре 18-22 С в 3 повторностях, с параллельной постановкой контрольного теста путем экспонирования данной тест-культуры при тех же условиях водой, используемой для разведения, подсчитывают количество иммобилизованных особей, рассчитывают для каждого разведения индекс иммобилизации особейпо формуле 100,где- индекс иммобилизации для -го разведения,- среднее арифметическое количество иммобилизованных особей в контроле- среднее арифметическое количество иммобилизованных особей для -го разведения,на основании полученных значенийопределяют показатель , соответствующий наименьшей кратности разведения водной вытяжки из промышленных отходов, не оказывающей токсического воздействия на тест-культуру, и при значении 110000 промышленные отходы оценивают как чрезвычайно опасные и относят кклассу опасности если значениенаходится в диапазоне от 110000 до 11001, то промышленные отходы оценивают как высокоопасные и относят коклассу опасности если значениенаходится в диапазоне от 11000 до 1101, то промышленные отходы оценивают как умеренно опасные и относят кклассу опасности при значении 1100 промышленные отходы оценивают как малоопасные и относят кклассу опасности при отсутствии токсического воздействия на тест-культуруводной вытяжки из промышленных отходов без разведения промышленные отходы оценивают как нетоксичные и относят кклассу опасности. Изобретение относится к разделу токсикологии. Заявителю неизвестен способ оценки токсичности отходов с использованием ракообразных, в силу чего не может быть указан объект, являющийся наиболее близким аналогом заявляемого способа. Задачей заявленного изобретения является разработка способа оценки токсичности промышленных отходов и критериев оценки опасности. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ оценки токсичности промышленных отходов, при котором осуществляют экспонирование тест-культуры водных ракообразных, обладающей чувствительностью к референсному веществу дихромату калия на уровне ЭК 50-9078 (70,985,8) мг/дм 3, ЭК 16-9625,5 мг/дм 3, ЭК 84-96230 мг/дм 3, водной вытяжкой из промышленных отходов без разведения и в диапазоне разведений от 110 до 11000000 в течение 96 часов при температуре 18-22 С в 3 повторностях, с параллельной постановкой контрольного теста путем экспонирования данной тест-культуры при тех же условиях водой, используемой для разведения, подсчитываю количество иммобилизованных особей, рассчитывают для каждого разведения индекс иммобилизации животныхпо формуле 100 ,где- индекс иммобилизации особей для -го разведения,- среднее арифметическое количество иммобилизованных особей в контроле- среднее арифметическое количество иммобилизованных особей для -го разведения,на основании полученных значенийопределяют показатель , соответствующий наименьшей кратности разведения водной вытяжки из промышленных отходов, не оказывающей токсического воздействия на тест-культур, и при значении 2 16204 1 2012.08.30 110000 промышленные отходы расценивают как чрезвычайно опасные и относят кклассу опасности если значениенаходится в диапазоне от 110000 до 11001, то промышленные отходы оценивают как высокоопасные и относят коклассу опасности если значениенаходится в диапазоне от 11000 до 1101, то промышленные отходы оценивают как умеренно опасные и относят кклассу опасности при значении 1100 промышленные отходы оценивают как малоопасные и относят кклассу опасности при отсутствии токсического воздействия на тест-культуруводной вытяжки из промышленных отходов без разведения промышленные отходы оценивают как нетоксичные и относят кклассу опасности. Вид .низших ракообразных отряда(ракушковые) типичен для фауны Республики Беларусь и широко распространен на ее территории, обитая в постоянных,временных водоемах, а также подземных водах. Как тест-объектобладает рядом положительных характеристик образует стабильные популяции в любое время года, размножается партеногенетически, имеет надежные отличительные признаки. Культура, обладающая чувствительностью к референсному веществу дихромату калия на уровне ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3, хранится в рабочей коллекции Республиканского научно-практического центра гигиены под кодом ЦГ-2 (220012 Республика Беларусь, г. Минск, ул. Академическая, 8, тел. 284 13 86, факс 284 03 45) и может быть получена (закуплена) по запросу либо получена заинтересованным лицом из дикой природы путем полного следования этапам, описанным ниже. На фигуре показана схема получения тест-культуры, обладающей чувствительность к эталонному агенту дихромату калия в диапазоне ЭК 50-9678(70,985,8) мг/дм 3. Исходная лабораторная культура(культура 2 на схеме) была получена из животных, выделенных из природных условий - водных экосистем Минской области, Республика Беларусь (культура 1 на схеме - природная (дикая) культура). В лабораторных условиях была получена исходная культура, представляющая собой потомство одной самки - генетически однородна (культура 2 на схеме), в дальнейшем последующие серии культур (на схеме 31,32,33 3 - лабораторная культура .соответственно серий 1, 2, 3, , ), полученные из исходной, использовались как тест-объекты для проведения оценки острой водной токсичности (на схеме обозначено как- эксперименты с референсным агентом дихроматом калия). Последующий отбор проводился с учетом чувствительности к эталонному токсиканту (дихромат калия) и скорости роста культуры в лабораторных условиях (на схеме обозначено как ). В итоге была получена лабораторная генетически однородная культура ракообразных, зарегистрированная как ЦГ-2 (на схеме обозначена как 4), обладающая чувствительностью к эталонному агенту дихромату калия в следующем диапазоне ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3, ЭК 16-9625,5 мг/дм 3, ЭК 84-96230 мг/дм 3 (содержится в рабочей коллекции Республиканского научно-практического центра гигиены). Поддержание культуры осуществляется при световом режиме 12 ч день 12 ч ночь и температуре от 18 до 24 С, для кормления используется альгологически чистая культура водорослейс плотностью суспензии не менее 100106 клеток/мл, вносимая ежедневно и поддерживаемая в концентрации 105 клеток/мл. Эти условия являются оптимальными, способствуют поддержанию жизнедеятельности и воспроизводству особей, а также поддержанию постоянной чувствительности тест-культуры к эталонному агенту. Основными определительными фенотипическими признаками, используемыми в заявленном способе, являются следующие тело животных заключено в двустворчатую раковину длиной до 0,7 мм с латерально расположенными створками и снабжено 7 парами конечностей. При рассматривании сбоку наибольшая высота раковинки достигает 2/3 ее длины и расположена посередине. 3 16204 1 2012.08.30 Спинной край в средней части довольно сильно выпуклый, брюшной край слабо вогнут в средней части и образует выпуклость у ротового отверстия. Передний край равномерно и широко закруглен, задний уже переднего и косо закруглен. Со спинной стороны раковинка широко-яйцевидная наибольшая ширина приблизительно в середине раковинки и несколько превышает ее высоту задний конец закруглен, передний широко заострен левая створка превосходит спереди правую приблизительно на ширину своей кутикулярной каемки поверхность створок сильно волосиста, с маленькими ямочками на основном фоне желтовато-зеленоватых створок резко выступают 3 пары лентовидных темных пятен неправильных очертаний, которые идут от спинной стороны сначала поперек створок, а затем переднее пятно простирается вдоль передних краев створок, а два других пятна связываются на спинной стороне таким же пятном, идущим вдоль спинного края. Отличительная характеристика данной культуры - чувствительность к эталонному агенту дихромату калия в диапазоне ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3. Проведенные заявителем исследования показали высокую чувствительность предложенного способа оценки токсичности отходов. Время воздействия 96 часов обусловлено тем, что в течение этого периода времени максимально проявляются острые токсические эффекты химических веществ по отношению к. Общая схема проведения тестирования токсичности отходов в отношении культуры, обладающей чувствительностью к референсному веществу дихромату калия на уровне ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3, включает 2 основные стандартные процедуры - подготовка к тестированию и непосредственно тестирование. Этапы подготовки к тестированию 1) сбор имеющейся доступной информации о промышленных отходах детальное изучение технологического процесса, ведущего к образованию отходов производства,изучение химического состава компонентов, входящих в состав (интегральные и индивидуальные показатели) 2) разработка схемы исследований в зависимости от природы и потенциальной токсичности анализируемых промышленных отходов определяют последовательность тестируемых в эксперименте разведений водных вытяжек из отходов 3) культивирование или закупка тест-культуры адаптация культуры к тестовым условиям (температура, вода того же состава, что и используемая в тесте для приготовления вытяжек) в течение не менее 48 часов. Для исключения необходимости периода акклиматизации, культивационная вода должна иметь сходный состав (, жесткость) с водой,используемой для теста. Не реже 1 раза в 6 месяцев проводят тест с эталонным веществом(для подтверждения стабильности чувствительности тест-культуры) в качестве эталонного вещества используют бихромат калия 4) отбор организмов для проведения тестирования. Тест-культура культивируется в лабораторных условиях со световым режимом 12 ч день 12 ч ночь. Для культивирования используется стеклянная посуда, для ежедневного кормления - культура водорослей. За сутки до начала тестирования отбираются подвижные юные особи, из которых в день проведения опыта отбирают животных размером не более 0,3 мм 5) приготовление водных вытяжек из отходов. Водная вытяжка из отходов готовится из соотношения твердая фазажидкость, равного 110. В качестве жидкости используется культивационная вода 6) приготовление разведений водной вытяжки для биотестирования. В качестве воды для приготовления растворов используют восстановленную либо дехлорированную отстаиванием в течение не менее 3 суток водопроводную воду. Разведения готовят непосредственно перед внесением тест-организмов, эксперимент начинают не позднее чем через 30 минут с момента приготовления растворов. 16204 1 2012.08.30 Процедура непосредственно тестирования. В ходе эксперимента ракообразных в течение 96 часов экспонируют вытяжками из отходов в диапазоне разведений. Животные, экспонируемые каждой концентрацией, должны быть разделены на группы по 10 особей в каждой. Параллельно ставят не менее 3 серий разведений. В дополнение к серии разведений ставят контроль чистоты эксперимента (исходная вода для приготовления разведений). Тест проводят с чередованием циклов света и темноты 16 ч 8 ч либо 12 ч 12 ч соответственно с 15-30-минутным переходным периодом. Температура должна быть в пределах 18 и 22 С, но для каждого отдельного теста должна быть постоянной в пределах 1 С.в контроле и тестовых растворах измеряют в начале теста, через 24 ч и в конце теста. Учет результатов тестирования через 24, 48 и 96 часов микроскопированием при увеличении 2-7. В качестве токсического эффекта расценивается иммобилизация животных. Иммобилизация - отсутствие у ракообразных способности к движению в течение 15 секунд после легкого встряхивания тестируемого субстрата. Иммобилизованных животных удаляют из сосудов после регистрации наблюдений. При проведении тестирования должны быть соблюдены следующие критерии качества 1) значениедолжно варьировать не более чем на 1 единицу 2) иммобилизация в контролях не должна превышать 10 . На основании учета результатов эксперимента рассчитывается индекс иммобилизации животныхдля каждого разведения по формуле 100 ,где- индекс иммобилизации животных для разведения,- среднее арифметическое количество иммобилизованных животных в контроле,- среднее арифметическое количество иммобилизованных животных для разведения . На основании полученных значенийнаходят значение наименьшей кратности разведения водной вытяжки, не оказывающей токсического воздействия на тест-культуру, обладающую чувствительностью к референсному веществу дихромату калия на уровне ЭК 509678 (70,985,8) мг/дм 3 . Наименьшая кратность разведения водной вытяжки, не оказывающая токсического воздействия , - это экспериментально установленная наименьшая кратность разведения водной вытяжки, вызывающая изменение тест-реакции (в данном случае иммобилизацию) не более чем у 10 особей тестируемой популяциипо сравнению с контролем в течение 96-часовой экспозиции. На основании значениясудят о токсичности промышленных отходов и устанавливают их класс опасности в соответствии с диапазонами кратности разведений, представленными в табл. 1. Таблица 1 Класс опасности промышленного отхода(наименьшая кратность разведения водной вытяжки,не оказывающая токсического воздействия на ракообразных из тест-культуры .ЦГ-2) более 10000 10000-1001 1000-101 100 и ниже 1 16204 1 2012.08.30 Пример Задача Требуется определить токсичность отходов производства(образцы 1,2,3, 4,5). Решение. Для оценки токсичности отходов производствавыполняют экспериментальные исследования с использованием в качестве тест-объектов тест-культуры ракообразных, содержащихся в рабочей коллекции Республиканского научно-практического центра гигиены под кодом ЦГ-2. Подготовку тест-культуры к исследованию, водных вытяжек из отходов и тестирование проводят в соответствии с методикой, указанной выше. С целью установления наименьшей кратности разведения водной вытяжки, не оказывающей токсического воздействия , готовят разведения водных вытяжек в 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 раз. При этом в указанном ряду кратность разведения увеличивается от 1 (нативная вытяжка без разведения) к 1000000-кратному разведению. Эксперимент ставят в 3 повторностях для каждого разведения и параллельно 3 контроля. Количество животных в группе - по 10 особей. Результаты эксперимента представлены в табл. 2 (графы 1-5). Анализ полученных данных необходимо производить от наименьшего разведения(разведение 1 (нативная вытяжка), к наибольшему (1000000-кратному разведению). При этом искомым значениембудет наименьшее значение кратности разведения, для которого 10 . Результаты анализа (значения ) представлены в графе 6 табл. 2, а пояснения по решению задачи отражены курсивом в графе 5 этой же таблицы. На основании экспериментально полученных значенийс применением табл. 1 тестируемые промышленные отходы относят к классу опасности. Таким образом, тестируемые промышленные отходы относят (графа 6 табл. 2) образец 1 кклассу опасности - умеренно опасные промышленные отходы, индекс имразведения Количество животных (ср. арифм. по па, класс мобилизации раллельным сериям) вытяжки животных опасности животных, индекс имразведения Количество животных (ср. арифм. по памобилизации раллельным сериям) вытяжки животных животных 100000 разкласс опасности чрезвычайно опасные(100),образец 3 кклассу опасности - нетоксичные промышленные отходы (1),образец 4 кклассу опасности - высокоопасные промышленные отходы(10000),образец 5 кклассу опасности - чрезвычайно опасные промышленные отходы(100000). Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа заключается в расширении арсенала способов оценки токсичности промышленных отходов путем использования культуры мелких водных ракообразных, обладающей чувствительностью к референсному веществу дихромату калия на уровне ЭК 50-9678(70,985,8) мг/дм 3, что позволит избежать недооценки опасности, надежно определить токсичность и классифицировать отходы с позиций опасности для окружающей среды. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.