Конъюгаты йодированных производных тиронина с биотином или 2-иминобиотином в качестве бифункциональных связывающих компонентов в иммунодиагностических системах

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ КОНЪЮГАТЫ ЙОДИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ТИРОНИНА С БИОТИНОМ ИЛИ 2-ИМИНОБИОТИНОМ В КАЧЕСТВЕ БИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВЯЗЫВАЮЩИХ КОМПОНЕНТОВ В ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Новаковский Максим Евгеньевич Вашкевич Ирина Игнатьевна Свиридов Олег Васильевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) Конъюгат йодированного производного тиронина с биотином или 2-иминобиотином общей формулы Конъюгаты йодированных производных тиронина с биотином или 2-иминобиотином в качестве бифункциональных связывающих компонентов в иммунодиагностических системах. Изобретение относится к области биоорганической химии, а именно к новым химическим соединениям общей формулы- или . Заявляемые соединения могут быть использованы в качестве бифункциональных связывающих компонентов в иммунодиагностических системах с участием биотинсвязывающих соединений и антител против одного или нескольких йодтиронинов. В качестве биотинсвязывающих соединений могут быть использованы авидины, стрептавидин, ,, антитела против биотина и (или) остатка биотина в составе макромолекул, биотинсвязывающие протеины желтка яиц, биотинидаза. В разной степени йодированные по фенильному и феноксильному кольцам производные тиронина являются природными низкомолекулярными соединениями. Среди них 3,3,5-трийодтиронин (Т 3) и 3,3,5,5-тетрайодтиронин (Т 4, тироксин), вырабатываемые щитовидной железой, являются важными йодаминокислотными гормонами, которые играют существенную роль в регуляции общего метаболизма, развития и дифференцировки тканей животных. Они регулируют экспрессию генов, связываясь с ядерными рецепторами клеток-мишеней 1 и их уровень в сыворотке крови является очень важным клиническим и диагностическим показателем. 3,3,5-трийодтиронин (обратный Т 3), дийодтиронины и монойодтиронины являются продуктами ферментативного дейодирования Т 3 и Т 4. Биотин (витамин Н) является важным коферментом ряда карбоксилаз у животных и растений. Кроме того, он является природным лигандом для авидина, стрептавидина,брадивидина и других биотинсвязывающих белков, с которыми связывается с очень высоким сродством (Ка 10-12-10-14 М-1) даже в жестких условиях. 2-иминобиотин в отличие от биотина полностью теряет сродство к биотинсвязывающим белкам в растворах с кислым. Эти свойства витамина и его синтетического производного нашли широкое применение в разнообразных биохимических и медицинских научных и практических приложениях. В литературе описано получение и применение широкого спектра производных тироидных гормонов, которые, в зависимости от внесенных изменений, обладают новыми и полезными для практики свойствами. Запатентованы бифункциональные конъюгаты тироидных гормонов с ФАД 2, тирозином 3, рядом ферментов 4, инсулином 5, дикетопиперазинами 6, флуоресценом 7. Недостаток - отсутствие у перечисленных соединений способности связываться с биотинсвязывающими белками. Известно высокомолекулярное соединение, способное связывать стрептавидин и антитела против тироксина, которое представляет собой биотинилированный конъюгат Т 4 с бычьим сывороточным альбумином 8 (прототип). Заявляемое соединение может быть использовано в качестве связывающего компонента в иммуноферментной тест-системе для определения уровня Т 4 в сыворотке крови человека. Недостаток - конъюгаты с белками-носителями отличаются сильной вариацией связывающих свойств, нестабильностью,небольшим сроком годности и, как следствие, сложностью в применении. Задачей настоящего изобретения являются стабильные низкомолекулярные конъюгаты йодированных производных тиронина с биотином и 2-иминобиотином общей сруктур 2 12989 1 2010.04.30 ной формулы 1. Наличие в заявляемых соединениях по одному остатку биотина и йодтиронина обеспечивает возможность связывания конъюгатов с одним связывающим центром биотинсвязывающего белка и с одним паратопом антитела против йодтиронина. Такие конъюгаты могут быть использованы в качестве бифункциональных связывающих компонентов в иммунодиагностических системах, в том числе в тест-системах для иммунохимического количественного определения Т 3 или 4. Поставленная задача решается заявляемыми соединениями, которые получают по схеме 1 путем -ацилирования -(3-аминопропил)биотинамида или -(3-аминопропил)2 иминобиотинамида -оксисукцинимидным эфиром соответствующего -ацетилйодтиронина, полученного реакцией ,-дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК) в присутствии где 1- или 2- или 3- или 4- или-О или . Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения. Пример 1 Получение -2-(2-ацетамидо-3-(4-(4-окси-3,5-дийодофенокси)-3,5-дийодофенил)пропанамидо)пропил-5-(2-оксо-гексагидро-1 Н-тиено 3,4-имидазол-4-ил)пентанамида (соединение 1, где 1- 2- 3- 4- -О). 1 г (1,12 ммоль) пентагидрата натриевой соли -тироксина растворяют в 300 мл этилового спирта и добавляют 220 мг (1,7 ммоль) ацетоксисукцинимида. Перемешивают 20 ч при комнатной температуре,8,5. Этанол упаривают в вакууме, остаток растворяют в этилацетате и промывают 0,1 н. , затем водой, высушивают 24, упаривают в вакууме. Получают 0,86 г (1,05 ммоль, выход 94 ) -ацетилтироксина. Разлагается до достижения температуры плавления.0,28(-, 21). 0,165 г (0,2 ммоль) -ацетилтироксина растворяют в 30 мл абс. диоксана и вносят 0,032 г (0,28 ммоль) -оксисукцинимида. Раствор охлаждают до 0 С и по каплям добавляют 0,045 мг (0,22 ммоль) ,-дициклогексилкарбодиимида в 2 мл диоксана. Перемешивают 1 ч при 0 С и 20 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок дициклогексилмочевины отфильтровывают, к фильтрату добавляют 0,29 г (0,24 ммоль) трифторацетата -(3-аминопропил)биотинамида в 2 мл 0,1 М 3 и перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывают, промывают последовательно водой, содой, водой, 0,1 М , водой и высушивают безводным 24. Получают 0,15 г (0,13 ммоль, выход 66 ) -2-(2-ацетамидо-3-(4-(4-окси-3,53 12989 1 2010.04.30 дийодофенокси)-3,5-дийодофенил)пропанамидо)пропил-5-(2-оксо-гексагидро-1 Н-тиено 3,4-имидазол-4-ил)пентанамида. Разлагается до достижения температуры плавления.0.43(-, 21). 1 Н-ЯМР(500 МГц, 6-ДМСО), , м.д. 1.30(м, 4 Н, -С 2-), 1.48(м,6 Н, -СН 2-), 1.79(с, 3 Н, -СН 3), 2.06(т, 2 Н, 7.2, -Н-С(О)-С 2-), 2.82(дд, 1 Н, 15.03, 212.46,СН-СНаН), 2.91(дд, 1, 15.01, 213.31, СН-СаН), 3.05(м, 5 Н, СН 2-С(СН)- -Н-С 2-СН 2-С 2-), 4.13(м, 1, С(СН)-СН(-)-), 4.31(м, 1, -Н-С(СН)СН 2), 4.42(м, 1, -СН 2-С(Н-)-С(О)-), 6.39(с, 1, СН(СН)-СН(-)-), 6.47(с, 1,СН(СН)-СН 2), 7.05(с, 2 Н, -А 22-), 7.77(уш.т, 1 Н, 4.8, СН-С(О)СН 2-),7.79(с, 2 Н, -22-СН 2-), 8.06(уш. т, 1 Н, 4.8, -(СН 2)3 С-), 8.20(д, 1 Н, 8.39,СН 3 С(О)). Пример 2 Получение -2-(2-ацетамидо-3-(4-(4-окси-3,5-дийодофенокси)-3-йодофенил)пропанамидо)пропил-5-(2-оксо-гексагидро-1-тиено 3,4-имидазол-4-ил)пентанамида (соединение 1, где 1-Н 2- 3- 4 О). 0,75 г (1,12 ммоль) натриевой соли 3,3,5-трийодтиронина растворяют в 300 мл этилового спирта и добавляют 220 мг (1,7 ммоль) ацетоксисукцинимида. Перемешивают 20 ч при комнатной температуре,8,5. Этанол упаривают в вакууме, остаток растворяют в этилацетате и промывают 0,1 н. , затем водой, высушивают 24, упаривают в вакууме. Получают 0,7 г(1,01 ммоль, выход 92 ) -ацетилтрийодтиронина. Разлагается до достижения температуры плавления.0,23(-, 21). 0,14 г (0,2 ммоль) -ацетилтрийодтиронина растворяют в 30 мл абс. диоксана и вносят 0,032 г (0,28 ммоль) -оксисукцинимида. Раствор охлаждают до 0 С и по каплям добавляют 0,045 мг (0,22 ммоль) ,-дициклогексилкарбодиимида в 2 мл диоксана. Перемешивают 1 ч при 0 С и 20 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок дициклогексилмочевины отфильтровывают, к фильтрату добавляют 0,29 г (0,24 ммоль) трифторацетата -(3-аминопропил)биотинамида в 2 мл 0,1 М 3 и перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывают, промывают последовательно водой, содой, водой, 0,1 М , водой и высушивают безводным 24. Получают 0,13 г (0,13 ммоль, выход 65 ) -2-(2-ацетамидо-3-(4-(4-окси-3,5 дийодофенокси)-3-йодофенил)пропанамидо)пропил-5-(2-оксо-гексагидро-1 Н-тиено 3,4 имидазол-4-ил)пентанамида. Разлагается до достижения температуры плавления.0.35(-, 21). 1 Н-ЯМР(500 МГц, 6-ДМСО), , м.д. 1.30(м, 4 Н, -С 2-), 1.48(м, 6 Н,-С 2-), 1.79(с, 3, -С 3), 2.06(т, 2 Н, 7.2, С(О)-С 2-), 2.82(дд, 1, 15.03, 212.46,СН-СНа), 2.91(дд, 1 Н, 15.01, 213.31, СН-СаН), 3.05(м, 5 Н, СН 2-С(СН)- -Н-С 2-СН 2-С 2-), 4.13(м, 1, -Н-С(СН)-(-)-), 4.31(м, 1 Н, -Н-С(СН)СН 2), 4.42(м, 1 Н, -СН 2-С(Н-)-С(О)-), 6.39(с, 1, СН(СН)-СН(-)-), 6.47(с, 1,6.74(,1,СН(СН)-СН 2),6.56(,1,),), 7.06(с, 1,), 7.77(уш. т, 1 Н,4.8, СН-С(О)СН 2-), 7.79(с, 2 Н, -А 22-СН 2-), 8.06(уш. т, 1, 4.8, -(СН 2)3 С-),8.20(д, 1, 8.39, СН 3 С(О)). Пример 3 Получение -(3-(2-ацетамидо-3-(4-(4-оксифенокси)-3,5-дийодофенил)пропанамидо)пропил)-5-(2-иминогексагидро-1-тиено 3,4-имидазол-4-ил)пентанамид (соединение 1,где 1-Н Х 2-Н Х 3- Х 4- -). 0,59 г (1,12 ммоль)3,5-дийодтиронина растворяют в 300 мл этилового спирта и добавляют 220 мг (1,7 ммоль)ацетоксисукцинимида. Перемешивают 20 ч при комнатной температуре,8,5. Этанол упаривают в вакууме, остаток растворяют в этилацетате и промывают 0,1 н. , затем водой, высушивают 24, упаривают в вакууме. Получают 0,57 г (1,01 ммоль, выход 92 )-ацетилдийодтиронина. Разлагается до достижения температуры плавления.0,18(-, 21). 4 12989 1 2010.04.30 0,11 г (0,2 ммоль) -ацетилдийодтиронина растворяют в 30 мл абс. диоксана и вносят 0,032 г (0,28 ммоль) -оксисукцинимида. Раствор охлаждают до 0 С и по каплям добавляют 0,045 мг (0,22 ммоль) ,-дициклогексилкарбодиимида в 2 мл диоксана. Перемешивают 1 ч при 0 С и 20 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок дициклогексилмочевины отфильтровывают, к фильтрату добавляют 0,23 г (0,24 ммоль) трифторацетата -(3-аминопропил)2-иминобиотинамида в 2 мл 0,1 М 3 и перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывают, промывают последовательно водой, содой, водой, 0,1 М , водой и высушивают безводным 24. Получают 0,11 г (0,13 ммоль, выход 66 ) -(3-(2-ацетамидо-3-(4-(4-оксифенокси)-3,5-дийодофенил)пропанамидо)пропил)-5-(2-иминогексагидро-1-тиено 3,4 имидазол-4-ил)пентанамида. Разлагается до достижения температуры плавления.0,43(-, 21). 1.30(м, 4 Н, -С 2-), 1.48(м, 6 Н, -С 2-), 1.79(с, 3 Н, -С 3), 2.0(с, 2 Н,С(Н)), 2.06(т, 2 Н, 7.2, -Н-С(О)-С 2-), 2.85(дд, 1 Н, 1 5.03, 2 12.46, СНСНа), 3.05(м, 5 Н, СН 2-С(СН)-Н-С 2-СН 2-С 2-), 3.1(дд, 1, 15.01, 213.31,СН-СаН), 3.23(м, 2 Н, С-С), 4.42(м, 1, -СН 2-С(Н-)-С(О)-), 6.75(, 2,), 6.69(, 2,), 7.45 (с, 2 Н,-А 22-СН 2-), 7.8(м, 2 Н, СН-С(О)СН 2-С), 8.01(уш. т, 1 Н, 4.8, -(СН 2)3-С(О)-), 8.32(д, 1, 8.39, СН 3 С(О)). Заявляемые конъюгаты йодированных производных тиронина с биотином или 2 иминобиотином могут быть использованы в качестве бифункциональных компонентов в иммунодиагностических системах для количественного определения уровней свободных тирогормонов, что подтверждается примерами конкретного выполнения. Представленные примеры не ограничивают вариантов их применения. Пример 4 Проведение иммуноферментного анализа свободного Т 3 в сыворотке крови человека. В полистирольные лунки планшета с иммобилизованным авидином вносят по 50 мкл калибровочных проб, содержащих 0, 1.5, 3, 6, 12 и 24 пмоль/л свободного Т 3 или анализируемых образцов, содержащих свободный Т 3, в дубликатах. Вносят во все лунки по 25 мкл фосфатно-буферного раствора конъюгата антиТ 3-пероксидаза хрена. Планшеты инкубируют в течение 45 мин при комнатной температуре со встряхиванием, затем вносят во все лунки по 25 мкл конъюгата биотин-Т 3 и продолжают встряхивание в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем удаляют жидкость из лунок и промывают их трижды фосфатнобуферным раствором, содержащим 0,9 и 0,0220. Во все промытые лунки добавляют по 100 мкл хромоген-субстратного буфера (раствор 3,3,5,5-тетраметилбензидина в субстратном буфере с перекисью водорода) и инкубируют при комнатной температуре без встряхивания в течение 15 минут. Останавливают реакцию добавлением во все лунки по 100 мкл раствора стоп-реагента (4,8 раствор 24). Измеряют на спектрофотометре оптическую плотность раствора во всех лунках при длине волны 450 нм. В прямых координатах строят график зависимости оптического сигнала от концентрации свободного Т 3 в калибровочных пробах (пмоль/л). Типичная для этой системы калибровочная кривая имеет линейную зависимость и максимальное значение сигнала в диапазоне 1,6-2,2 о.е., который падает на 80 в последней точке калибровочного диапазона. Значения концентраций свободного Т 3, определенные в контрольных сыворотках,попадают в предписанные интервалы (табл. 1). Таблица 1 Открытие контрольных сывороток различных диапазонов концентраций предписанные значения сво- открытые значения свободбодный Т 3, пМ ный Т 3, пМ контрольная сыворотка 1 2,8-4,0 3,7 контрольная сыворотка 2 8,9-2,7 10,3 контрольная сыворотка 3 13,9-24,2 24,0 5 12989 1 2010.04.30 Пример 5 Проведение лантанидного иммунофлуоресцентного анализа свободного Т 4 в сыворотке крови человека. В лунки микропланшета с иммобилизованными антителами к Т 4 вносят последовательно по 0,03 мл калибровочных проб, содержащих 0, 2.5, 12, 24 и 72 пмоль/л свободного Т 4 или анализируемых образцов сывороток крови человека, содержащих свободный Т 4 и по 0,07 мл предварительно сформированного комплекса Бт-Т 4 со стрептавидином (в мольном соотношении 1 к 2), меченным( , Финляндия), с концентрацией 20 мкг/л в пересчете на стрептавидин. После инкубации 2 ч при 37 С при постоянном встряхивании жидкую фазу удаляют и промывают лунки пять раз по 0,2 мл промывочного буфера для( , Финляндия). Затем добавляют по 0,15 мл усиливающего раствора для( , Финляндия) и после мягкого перемешивания в течение 5 минут при комнатной температуре измеряют лантанидную флуоресценцию с разрешением во времени (-) на флуориметре (возбуждение/испускание 340/617 нм, время задержки - 300 мкс). В прямых координатах строят график зависимости полученных значенийв относительных единицах от концентрации свободного Т 4 в калибровочных пробах. Типичная калибровочная кривая в начале имеет вогнутую форму, обеспечивая повышенную чувствительность при низких концентрациях свободного Т 4, и приобретает прямолинейность в диапазоне концентраций 15-70 пмоль/л свободного гормона. Значения концентраций свободного Т 4, определенные в контрольных сыворотках, попадают в предписанные интервалы (табл. 2). Таблица 2 Открытие контрольных сывороток различных диапазонов концентраций предписанные значения сво- открытые значения свободбодный Т 4, пМ ный Т 4, пМ контрольная сыворотка 1 5-6,8 5,5 контрольная сыворотка 2 9-15 12 контрольная сыворотка 3 52-59 56 Приведенные в примерах 4 и 5 данные подтверждают, что заявляемые соединения могут быть использованы в качестве бифункциональных связывающих компонентов в иммунодиагностических системах с участием биотинсвязывающих соединений и антител против одного или нескольких йодтиронинов, в частности, для иммуноферментного анализа свободного Т 3 и иммунофлуоресцентного анализа свободного Т 4 в сыворотке крови человека. Источники информации 1. Мари Р. Биохимия человека. - М. Мир, 1993. 2.4,171,432.-заявл. 22.06.78 опубл. 16.10.79. 3.3,983,099. --заявл. 19.03.75 опубл. 28.09.1976. 4.4,040,907.заявл. 29.12.75 опубл. 09.08.77. 5.2003/0186847 1.заявл. 10.07.01 опубл. 02.10.2003. 6.2002/0038026 1.заявл. 02.08.01 опубл. 28.03.02. 7.5,648,272.заявл. 18.05.95 опубл. 15.07.97. 6 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7