Способ определения нарушения функционального состояния миелопероксидазы в плазме крови

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАРУШЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ В ПЛАЗМЕ КРОВИ(71) Заявители Белорусский государственный университетФедеральное государственное учреждение Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медикобиологического агентства(72) Авторы Горудко Ирина ВладимировнаПанасенко Олег МихайловичСоколов Алексей ВикторовичКостевич Валерия АлександровнаБуко Инна ВацлавовнаКонстантинова Елена ЭриховнаВасильев Вадим БорисовичЧеренкевич Сергей НиколаевичСергиенко Валерий Иванович(73) Патентообладатели Белорусский государственный университетФедеральное государственное учреждение Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства(56)13675 1, 2010.42092 , 2009... 1999. - . 273. - . 1. - . 126-132. РВАЧЕВ А.В. Клинико-диагностическое значение определения миелопероксидазы в моноцитах и нейтрофилах периферической крови больных ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, системной склеродермией, болезнью Бехтерева и реактивными артритами Автореф. дис. - Волгоград, 2002. - С. 4, 24.1474512 1, 1989.21951 , 2007.(57) Способ определения нарушения функционального состояния миелопероксидазы в плазме крови, заключающийся в том, что в образце плазмы крови определяют активность миелопероксидазы спектрофотометрически по разности скорости окисления -дианизидина пероксидом водорода в отсутствии и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфатно-цитратном буфере 4,5, определяют концентрацию миелопероксидазы с помощью ИФА с использованием аффинных антител против миелопероксидазы,рассчитывают значение коэффициента удельной активности Куа миелопероксидазы, равное отношению активности фермента к его концентрации, и констатируют нарушение функционального состояния миелопероксидазы в плазме крови при значении Куа выше 1,65 ед. оптической плотности в минуту на пг миелопероксидазы. Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии, и может быть использовано для определения нарушения функционального состояния фермента миелопероксидазы (МПО) в плазме крови путем одновременного измерения ее концентрации и активности. 18615 1 2014.10.30 Миелопероксидаза (МПО) - фермент, содержащийся в лейкоцитах, - секретируется во внеклеточное пространство в очагах воспаления. Этот фермент катализирует образование окислителей (, ), которые являются не только основой антимикробного потенциала нейтрофилов, но и способны вызывать повреждение собственных тканей организма в очагах воспаления и последующее развитие окислительного стресса. Таким образом, активность фермента определяет не только эффективность клеточного ответа в отношении патогена, но и степень повреждающего действия окислителей в отношении клеток и тканей организма-хозяина. Активность МПО может регулироваться различными факторами, присутствующими в плазме крови. Так показано, что церулоплазмин, связываясь с МПО, ингибирует ее пероксидазную и хлорирующую активности, претендуя на роль эндогенного ингибитора активности фермента 1, 2. Важным регулятором активности МПО является такжесреды 3. Определение функционального состояния МПО позволит прогнозировать развитие ряда заболеваний, ассоциированных с окислительным стрессом и воспалением. Известен иммунохимический способ определения количества МПО в биологических жидкостях, основанный на иммуноферментном методе анализа (ИФА) с применением моноклональных антител к этому ферменту 4. Однако данный метод не дает возможности оценить функциональную активность МПО, от которой, в первую очередь, зависит, насколько интенсивна наработка этим ферментом реакционных продуктов-окислителей, и которая в конечном итоге определяет степень повреждения биологически важных молекул, а вместе с тем - степень тяжести течения заболевания и развитие его осложнений. Известен способ определения пероксидазной активности МПО в сыворотке (плазме) крови, который заключается в том, что в 50 мМ фосфатный буфер ( 6,0) вносят сыворотку крови, затем добавляют пероксид водорода и о-дианизидин, являющийся субстратом пероксидаз, после чего в течение 5 мин измеряют оптическую плотность реакционной смеси при 460 нм, регистрируя скорость окисления о-дианизидина, которая и является мерой пероксидазной активности и функционального состояния МПО 5. Однако данный метод имеет существенные недостатки, поскольку, во-первых, не учитывает возможного присутствия в сыворотке (плазме) помимо МПО соединений, обладающих пероксидазной активностью, например гемоглобина и/или его производных, а во-вторых, не позволяет оценивать удельную активность фермента, а следовательно, и его функциональное состояние, так как остается неясным, какое количество МПО содержится в образце плазмы и обладает измеряемой активностью. Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ определения пероксидазной активности МПО плазмы, включающий внесение субстрата о-дианизидина в разбавленную фосфат-цитратным буферным раствором ( 4,5) плазму крови в отсутствии и в присутствии ингибитора МПО - гидразида 4-аминобензойной кислоты. Пероксидазную активность МПО в плазме крови определяют по разности скоростей окисления субстрата о-дианизидина в отсутствии и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты 6. Этот способ дает возможность исключить вклад гемоглобина и других пероксидаз в получаемый результат. Однако данный способ, как и предыдущий, не позволяет определить удельную активность фермента и функциональное состояние МПО, так как не учитывает количество МПО, присутствующее в исследуемом образце плазмы. Задачей изобретения является создание способа определения нарушения функционального состояния МПО в плазме крови, позволяющего повысить информативность,точность и диагностические возможности прототипа. Техническим результатом заявленного изобретения является оптимизация, повышение информативности и расширение функциональных возможностей способа, что дает возможность прогнозировать развитие ряда заболеваний, уточнять диагнозы и своевременно принимать меры, направленные на регулирование активности фермента. 18615 1 2014.10.30 Поставленная задача достигается тем, что в способе оценки функционального состояния МПО в плазме путем исследования пероксидазной активности МПО, включающем внесение о-дианизидина в качестве субстрата в разбавленную буферным раствором плазму крови, спектрофотометрическое определение скорости его окисления после добавления пероксида водорода и определение активности миелопероксидазы, в качестве буферного раствора используют фосфат-цитратный буфер с 4,5, пероксид водорода добавляют в концентрации 100-200 мкМ, спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата осуществляют в отсутствии и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты, активность миелопероксидазы определяют по разности скоростей окисления о-дианизидина в отсутствии и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты,дополнительно определяют концентрацию МПО путем внесения в лунки планшета аффинных антител против МПО, полученных от крыс, последующего добавления образцов плазмы либо стандарта МПО, количество МПО в образцах плазмы определяют, сравнивая интенсивность развития хромогенной реакции в лунках со стандартом, после последовательного добавления антител против МПО, полученных от кроликов, конъюгата пероксидазы хрена с антителами против антител кролика и хромогенного субстрата, затем вычисляют коэффициент удельной активности Куа, равный отношению активности фермента к его концентрации. Сущность изобретения состоит в том, что субстрат о-дианизидин вносят в разбавленную буферным раствором плазму крови в отсутствии и в присутствии гидразида 4-аминобензойной ксилоты, спектрофотометрически определяют скорость окисления субстрата после добавления пероксида водорода (100-200 мкМ), пероксидазную активность МПО в плазме крови определяют по разности скоростей окисления о-дианизидина в отсутствии и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфатно-цитратном буфере ( 4,5), дополнительно определяют концентрацию миелопероксидазы в плазме крови путем внесения в лунки планшета аффинных антител против МПО, полученных от крыс, последующего добавления образцов плазмы либо стандарта МПО, количество МПО в образцах плазмы определяют, сравнивая величину изменения оптической плотности в лунках со стандартом, после последовательного добавления антител против МПО, полученных от кроликов, конъюгата пероксидазы хрена с антителами против антител кролика и хромогенного субстрата, далее вычисляют коэффициент удельной активности МПО Куа, равный отношению активности фермента к его концентрации, и при значениях коэффициента удельной активности МПО выше 1,65 ед. оптической плотности в минуту на пг МПО констатируют нарушение функционального состояния МПО. Сущность изобретения поясняется фиг. 1-3, где на фиг. 1 проиллюстрирована взаимосвязь между концентрацией и пероксидазной активностью МПО в плазме крови здоровых людей на фиг. 2 показана взаимосвязь между концентрацией и пероксидазной активностью МПО в плазме крови больных сахарным диабетом 2-го типа на фиг. 3 показана взаимосвязь между концентрацией и пероксидазной активностью МПО в плазме крови больных ишемической болезнью сердца. Способ осуществляют следующим образом. Отделенную от клеточного осадка путем центрифугирования плазму крови в количестве 60-70 мкл вносят в спектрофотометрическую кювету объемом 0,8 мл, содержащую смесь лимонной кислоты и 24 ( 4,5) в отсутствии и в присутствии ингибитора МПО - гидразида 4-аминобензойной кислоты (50 мкМ), и субстрат о-дианизидин (380 мкМ). Пробу тщательно перемешивают непосредственно в кювете и начинают регистрацию увеличения ее оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 450-460 нм в течение 8-10 мин после добавления пероксида водорода (100-200 мкМ). Оптическим контролем служит проба, содержащая такой же, как и в опытной пробе, объем буферного раствора и субстрата. 3 18615 1 2014.10.30 Расчет активности фермента проводят по формулеинг 1 МПО,гдеи инг - прирост оптической плотности замин в отсутствии и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты соответственно- общий объем реакционной смеси- время измерения активности- объем образца плазмы. Измерения концентрации фермента проводят с помощью ИФА с использованием антител против МПО человека, полученных иммунизацией кроликов и крыс. В лунки полистирольного планшета на 12 ч при 4 С помещали 0,1 мл аффинных антител крыс против МПО человека (5 мг/л) в 0,1 М натрий-карбонатном буфере,9,4, после промывки планшета 0,0520 (/) в(-) проводили блокировку (3 -ное обезжиренное молоко (/) в -) в течение 1 ч (0,2 мл), затем в лунках инкубировали в течение 1 ч стандартные растворы МПО (3-250 нг/мл) или пробы плазмы, разведенные - (в 4-256 раз), после промывки планшета - в лунки помещали 0,1 мл антител кроликов против МПО (10 мг/л) в -, после промывки планшета- в лунки помещали 0,1 мл антител коз противкролика, конъюгированных с пероксидазой хрена (15000, ) в -. После отмывки планшета - оценку активности проводили выявляя пероксидазу с помощью хромогенной смеси к раствору 10 мг о-фенилендиамина в 1 мл этанола добавляли 11 мл 0,1 М натрий-цитратного буфера, 4,0 и 5 мМ 22, спустя 4-5 мин к 0,1 мл смеси в лунках добавляли 0,05 мл 6 М 24 и измеряли 492 на планшетном фотометре. Концентрацию МПО во фракциях рассчитывали по калибровочному графику с известными концентрациями МПО в диапазоне 3-250 нг/мл. Далее вычисляют коэффициент удельной активности Куа КуаАМПО/С,равный отношению активности фермента (АМПО) к его концентрации (С), который выражается в единицах, количественно равных изменению оптической плотности в минуту на пг фермента. При значениях Куа выше 1,65 ед. опт. пл./пг/мин констатируют нарушение функционального состояния МПО. Сущность и практическая применимость заявляемого способа иллюстрируются следующими примерами. Пример 1. Проведено клиническое обследование 47 добровольцев без выраженных признаков острых, инфекционных или аллергических заболеваний, без нарушений сердечного ритма и проводимости, без признаков воспаления и ишемической болезни сердца. Плазма крови была исследована по описанным выше методам. Коэффициент удельной активности МПО был равен 1,350,30 ед. опт. пл./пг/мин, что соответствует нормальному функциональному состоянию МПО. В группе этих людей существует достоверная положительная корреляционная зависимость между активностью и содержанием МПО в плазме крови, что иллюстрирует фиг. 1. Эти данные подтверждают нормальное функциональное состояние МПО. Пример 2. В НИИ кардиологии (г. Минск) было проведено обследование группы больных с установленным диагнозом сахарный диабет (СД) 2-го типа и ишемическая болезнь сердца (ИБС). Плазма крови была исследована по описанным выше методам. Коэффициент удельной активности МПО в плазме крови больных СД 2-го типа был равен 3,541,15 ед. опт. пл./пг/мин, а в группе больных ИБС - 1,710,37 ед. опт. пл./пг/мин,что соответствует нарушению функционального состояния МПО. Действительно, при исследовании показателей, характеризующих окислительно-восстановительные процессы в 4 18615 1 2014.10.30 плазме крови как больных СД 2-го типа, так и больных ИБС, было достоверно увеличено количество окисленного глутатиона и продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой, что свидетельствует о развитии окислительного стресса. Подтверждением нарушения функционального состояния МПО явилось также отсутствие достоверной корреляционной зависимости между активностью и содержанием МПО в плазме крови как больных СД 2-го типа, так и ИБС, что иллюстрируют фиг. 2 и 3. Таким образом, предлагаемый способ отличается оптимизацией, повышением информативности и расширением функциональных возможностей по сравнению с существующим способом, благодаря одновременной регистрации и количества, и активности МПО. Источники информации 1.,,,,,, ,, //. . - 2008. - . 42. - . 989-998. 2. Панасенко О.М., Чеканов А.В., Власова И.И., Соколов А.В., Агеева К.В., Пулина М.О., Черкалина О.С., Васильев В.Б. // Биофизика. - 2008. - Т. 53. -5. - С. 573- 581. 3. Власова И.И., Арнхольд Ю., Осипов А.Н., Панасенко О.М. // Биохимия. - 2006. Т. 71. - С. 825-837. 4..,.-.,.,,,,,, // . - 2001. - . 286. - . 2136-2142. 5..,.,,.,.,.,. //. . - 2006. - . 24. - . 307-311. 6. Патент 13675, МПК 0133/48, 2010. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6