Способ определения пероксидазной активности миелопероксидазы в плазме крови

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ В ПЛАЗМЕ КРОВИ(71) Заявитель Белорусский государственный университет(72) Авторы Горудко Ирина ВладимировнаПанасенко Олег МихайловичСоколов Алексей ВикторовичЧеренкевич Сергей НиколаевичСергиенко Валерий Иванович(73) Патентообладатель Белорусский государственный университет(57) Способ определения пероксидазной активности миелопероксидазы в плазме крови,включающий внесение о-дианизидина в качестве субстрата в разбавленную буферным раствором плазму крови, спектрофотометрическое определение скорости его окисления после добавления пероксида водорода и определение активности миелопероксидазы, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют фосфат-цитратный буфер с 4,5, пероксид водорода добавляют до концентрации 100-200 мкМ, спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата осуществляют в отсутствие и в присутствии ингибитора миелопероксидазы - гидразида 4-аминобензойной кислоты, активность миелопероксидазы определяют по разности скоростей окисления о-дианизидина в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты. Изобретение относится к биохимической диагностике, а именно к способам определения активности миелопероксидазы (МПО) в плазме крови. Являясь биохимическим маркером активации нейтрофилов, МПО может играть решающую роль при различных патологических состояниях, сопровождающихся воспалительной реакцией организма (атеросклероз, сердечно-сосудистые, онкологические,нейродегенеративные заболевания, нарушения дыхательной функции легких, при заболеваниях почек, системных васкулитах, ревматоидном артрите и др.). При секреторной де 13675 1 2010.10.30 грануляции или гибели нейтрофила МПО может в значительном количестве попадать в кровь, и образующиеся в результате ее функционирования сильные окислители - реакционные производные галогенов, азота, кислорода, в том числе и свободные радикалы - способны вызывать в очагах воспаления повреждение собственных тканей организма. Известны иммунохимические способы определения количества освобожденной лейкоцитами МПО, основанные на иммуноферментном методе анализа (ИФА) 1. Эти способы основываются на количественном выявлении МПО с применением моноклональных антител к этому ферменту. Однако ИФА является дорогостоящим методом,требующим наличия иммуноферментного анализатора, который имеется не в каждой клинике, его осуществление требует выполнения большого числа подготовительных операций. Но главное, данный метод не позволяет оценить функциональную активность МПО,от которой в первую очередь зависит, насколько интенсивна наработка этим ферментом реакционных продуктов-окислителей, и которая в конечном итоге определяет степень повреждения биологически важных молекул, а вместе с тем степень тяжести течения заболевания и развитие его осложнений. Активность МПО можно характеризовать как через продукцию гипогалоидных кислот(галогенирующая активность), так и через окисление ароматических субстратов по пероксидазному циклу (пероксидазная активность). Однако скорость реакции гипогалоидных кислот с функциональными группами биологически важных молекул плазмы крови настолько высока (106 М-1 с-1), что современные методы не в состоянии зарегистрировать их образование в плазме крови, а значит и определить в ней галогенирующую активность МПО. Оценка пероксидазной активности МПО в крови осложнена тем обстоятельством, что в плазме крови присутствуют гем-содержащие белки, выполняющие функцию пероксидазы, важнейшим из которых является гемоглобин. В качестве прототипа принят способ определения общей пероксидазной активности плазмы, включающий внесение в плазму крови субстрата, в качестве которого используют о-дианизидин, и спектрофотометрическое определение скорости его окисления в присутствии пероксида водорода (3 мМ) в фосфатном буфере ( 6,9) 2. Однако известный способ имеет недостатки, так как не позволяет оценивать пероксидазную активность именно присутствующей в плазме МПО, а лишь общей пероксидазной активности, включающей вклад как МПО, так и других псевдопероксидаз, маскирующих истинную активность МПО. Задачей изобретения является создание способа быстрого и реального определения пероксидазной активности МПО в плазме крови. Поставленная задача достигается тем, что в способе определения пероксидазной активности миелопероксидазы в плазме крови, включающем внесение о-дианизидина в качестве субстрата в разбавленную буферным раствором плазму крови, спектрофотометрическое определение скорости его окисления после добавления пероксида водорода и определение активности миелопероксидазы, в качестве буферного раствора используют фосфатцитратный буфер с 4,5, пероксид водорода добавляют до концентрации 100-200 мкМ,спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата осуществляют в отсутствие и в присутствии ингибитора миелопероксидазы гидразида 4-аминобензойной кислоты, активность миелопероксидазы определяют по разности скоростей окисления одианизидина в отсутствие и в присутствии гидразида-4-аминобензойной кислоты. Сущность изобретения состоит в том, что субстрат о-дианизидин вносят в разбавленную буферным раствором плазму крови в отсутствие и в присутствии гидразида 4 аминобензойной кислоты, спектрофотометрически определяют скорость окисления субстрата после добавления пероксида водорода (100-200 мкМ), пероксидазную активность МПО в плазме крови определяют по разности скоростей окисления субстрата о 2 13675 1 2010.10.30 дианизидина в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты. Сущность предлагаемого изобретения поясняется фиг. 1, фиг. 2, где на фиг. 1 приведена зависимость пероксидазной активности МПО в плазме от концентрации Н 2 О 2 на фиг. 2 показана -зависимость пероксидазной активности МПО в плазме. Способ позволяет определить активность МПО. Это дает возможность прогнозировать развитие заболеваний, уточнить диагноз и своевременно принять меры, направленные на регулирование активности этого фермента, а также провести мониторинг МПО во время клинических испытаний фармакологических препаратов. Стоимость определения сокращается в несколько тысяч раз, что делает способ экономически выгодным. Простота и скорость дают возможность использовать способ в экспресс-диагностике. Способ осуществляется следующим образом. Для работы используют спектрофотометр. Отделенную от клеточного осадка путем центрифугирования плазму крови в количестве 60-70 мкл вносят в спектрофотометрическую кювету объемом 0,8 мл, содержащую смесь лимонной кислоты и 24 ( 4,5) в отсутствие и в присутствии ингибитора МПО - гидразида 4-аминобензойной кислоты (50 мкМ), и субстрат о-дианизидин(380 мкМ). Пробу тщательно перемешивают непосредственно в кювете и начинают регистрацию увеличения ее оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 450460 нм в течение 8-10 мин после добавления пероксида водорода (100-200 мкМ). Оптическим контролем служит проба, содержащая такой же, как и в опытной пробе, объем буферного раствора и субстрата. Расчет активности фермента проводят по формулеинг.,МПО гдеи инг. - прирост оптической плотности в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты заминут- общий объем реакционной смеси- время измерения активности- объем образца плазмы. Пример 1, демонстрирующий выбор оптимальной концентрации пероксида водорода при определении пероксидазной активности МПО в плазме. В одну опытную кювету объемом 0,8 мл вносили 60 мкл плазмы, МПО в концентрации 100 нг/мл, фосфат-цитратный буфер ( 4,5) и субстрат - о-дианизидин (380 мкМ). В другую - все то же самое, плюс гидразид 4-аминобензойной кислоты в концентрации 50 мкМ. В контрольную кювету вносили 60 мкл физиологического раствора, буферный раствор в объеме, равном объему в опытной кювете и субстрат - о-дианизидин (380 мкМ). Содержание кювет тщательно перемешивали и одновременно в три кюветы добавляли раствор пероксида водорода. Предлагаемым способом была измерена пероксидазная активность МПО в плазме при разных концентрациях пероксида водорода (50-1000 мкМ). Содержимое кювет еще раз тщательно перемешивали и начинали регистрацию оптической плотности в опытных кюветах против контрольной пробы при длине волны 460 нм в течение 8-10 мин. Активность МПО в плазме рассчитывалась согласно формулеинг. гдеи инг. - прирост плотности плазмы крови замин в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты. Результаты измерений приведены на фиг. 1, откуда следует, что зависимость пероксидазной активности в плазме от концентрации пероксида водорода носит экстримальный характер. 3 13675 1 2010.10.30 Анализ данных, приведенных на фиг. 1, позволяет сделать вывод о том, что при концентрации пероксида водорода, равной 100-200 мкМ, активность МПО в плазме максимальна. Пример 2, демонстрирующий выбор значения , оптимального для определения пероксидазной активности МПО в плазме. Определение пероксидазной активности МПО плазмы проводили, как описано в примере 1, но при разных значениях . Пероксид водорода использовали в концентрации 100 мкМ. Результаты использования метода определения активности МПО при разных значенияхприведены на фиг. 2, откуда следует, что зависимость активности МПО в плазме относит экстримальный характер с максимумом при 4,5. Анализ данных, приведенных на фиг. 2, позволяет сделать вывод о том, что при значении , равном 4,5, активность МПО в плазме максимальна. Пример 3, демонстрирующий необходимость использования ингибитора МПО с целью исключения возможного искажения определяемого значения пероксидазной активности МПО присутствующим в плазме гемоглобином. Предлагаемым способом была измерена пероксидазная активность МПО в плазме, содержащей гемоглобин. Определение пероксидазной активности плазмы проводили, как описано в примере 1. Результаты использования метода определения МПО в плазме, содержащей МПО и гемоглобин, приведены в табл. 1. Таблица 1 Показатели пероксидазной активности МПО плазмы крови,содержащей гемоглобин МПО инг Плазма с добавками гемоглобина 0,037 0,036 0,001 Плазма с добавками МПО 0,026 0,001 0,025 Анализ данных, приведенных в табл. 1, позволяет сделать вывод о том, что использование ингибитора МПО - гидразида 4-аминобензойной кислоты позволяет в пределах ошибки эксперимента исключить влияние гемоглобина на определение активности МПО в плазме. Пример 4 Предлагаемым способом измерена активность МПО в плазме крови 5 человек. В одну опытную кювету объемом 0,8 мл вносили 60 мкл плазмы, фосфат-цитратный буфер ( 4,5) и субстрат - о-дианизидин (380 мкМ). В другую опытную кювету вносили все то же самое, плюс гидразид 4-аминобензойной кислоты в концентрации 50 мкМ. В контрольную кювету вносили 60 мкл физиологического раствора, буферный раствор в объеме, равном объему в опытной кювете и о-дианизидин (380 мкМ). Содержание кювет тщательно перемешивали и одновременно в три кюветы добавляли раствор пероксида водорода (100 мкМ). Содержимое кювет еще раз тщательно перемешивали и начинали регистрацию плотности в опытных кюветах против контрольной пробы при длине волны 460 нм в течение 8-10 мин. Активность МПО в плазме рассчитывалась согласно формулеинг. 0,8 0,06 гдеи инг. - прирост оптической плотности плазмы крови замин в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты 0,8 - объем реакционной смеси (мл) 0,06 - объем плазмы в опытной пробе (мл). Полученные результаты приведены в табл. 2. 4 13675 1 2010.10.30 Таблица 2 Показатели активности МПО в плазме Номер образца МПО 1 0,013 2 0,012 3 0,103 4 0,007 5 0,080 Анализ данных, приведенных в табл. 2, позволяет сделать вывод о том, что предлагаемый способ позволяет определить активность МПО в плазме крови. Таким образом, предлагаемый способ позволяет быстро и реально определить активность МПО, стоимость определения сокращается в несколько тысяч раз, что делает способ экономически выгодным. Источники информации 1. , ., , .-., , ., , , , , , , , ,, (2001) , 286, 2136-2142. 2. , (2003) . . . , 25, 831-834 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5