Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕМОГЛОБИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ(71) Заявители Белорусский государственный университетФедеральное государственное учреждение Научноисследовательский институт физикохимической медицины Федерального медико-биологического агентства(72) Авторы Горудко Ирина ВладимировнаПанасенко Олег Михайлович Григорьева Дарья ВладимировнаСоколов Алексей ВикторовичЧеренкевич Сергей НиколаевичСергиенко Валерий Иванович(73) Патентообладатели Белорусский государственный университетФедеральное государственное учреждение Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства(57) Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови, включающий внесение -дианизидина в разбавленный буферным раствором образец плазмы крови с последующим спектрофотометрическим определением скорости окисления-дианизидина после добавления пероксида водорода, отличающийся тем, что спектрофотометрическое определение скорости окисления -дианизидина осуществляют в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфат-цитратном буфере 5,5 и пероксида водорода в концентрации 2 мМ, при этом пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови определяют как скорость окисления -дианизидина. Изобретение относится к биохимической диагностике, а именно к способам определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови. Определение параметров, характеризующих окислительно-восстановительные и воспалительные процессы в крови, необходимо как для диагностики и прогнозирования течения заболеваний, так и для мониторинга эффективности проводимой терапии. Одним из таких важных показателей является пероксидазная активность плазмы крови, которая определяется преимущественно активностью железосодержащих белков - миелонероксидазы (МПО) и гемоглобина и его производных. Являясь основным компонентом эритроцитов, гемоглобин при патологических процессах в результате разрушения эритроцитов (гемолиза) в достаточно больших количест 17950 1 2014.02.28 вах (до 15,3 мкМ) может попадать в плазму крови. Так, показано изменение содержания свободного гемоглобина в плазме при гемолитических анемиях, сердечной недостаточности, сахарном диабете и др. МПО секретируется во внеклеточное пространство в результате дегрануляции или лизиса лейкоцитов в очагах воспаления. Повышение концентрации МПО, а также появление ее биомаркеров обнаружено при атеросклерозе, сердечно-сосудистых, онкологических,нейродегенеративных заболеваниях, нарушении дыхательной функции легких, при заболеваниях почек, системных васкулитах, ревматоидном артрите и др. Известен способ определения пероксидазной активности МПО в плазме, включающий внесение в плазму крови субстрата пероксидаз, в качестве которого используют -дианизидин, и спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата после добавления пероксида водорода (100-200 мкМ) в присутствии и в отсутствие ингибитора МПО - гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфат-цитратном буфере ( 4,5) (1). Однако данным способом нельзя оценить пероксидазную активность гемоглобина в плазме. В качестве прототипа принят способ определения общей пероксидазной активности плазмы, включающий внесение в плазму крови субстрата, в качестве которого используют-дианизидин, и спектрофотометрическое определение скорости его окисления в присутствии пероксида водорода (3 мМ) в фосфатном буфере ( 6,9) (2). Однако известный способ имеет недостатки, так как не позволяет избирательно оценивать пероксидазную активность присутствующего в плазме гемоглобина, а дает возможность определить лишь общую пероксидазную активность, включающую вклад как МПО, так и гемоглобина. Задачей изобретения является создание способа быстрого определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови. Поставленная задача достигается тем, что в способе определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови, включающем внесение о-дианизидина в разбавленный буферным раствором образец плазмы крови, последующее спектрофотометрическое определение скорости окисления -дианизидина осуществляется в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфат-цитратном буфере с 5,5 после добавления пероксида водорода в концентрации 2 мМ, при этом пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови определяют как скорость окисления -дианизидина. Сущность изобретения состоит в том, что -дианизидин вносят в разбавленный буферным раствором образец плазмы крови, спектрофотометрически определяют пероксидзаную активность гемоглобина как скорость окисления о-дианизидина после добавления 2 мМ пероксида водорода в фосфат-цитратном буфере с 5,5 в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты. Такие условия измерения позволяют минимизировать вклад миелопероксидазы в определяемую пероксидазную активность гемоглобина. Сущность предлагаемого изобретения поясняется фиг. 1, фиг. 2, где на фиг. 1 показана -зависимость пероксидазной активности гемоглобина (1 мкМ) в плазме на фиг. 2 приведена зависимость пероксидазной активности гемоглобина (1 мкМ) в плазме от концентрации 22. Способ позволяет определить пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови. Это дает возможность прогнозировать развитие заболеваний, уточнить диагноз и своевременно принять меры, направленные на регулирование пероксидазной активности гемоглобина, а также провести мониторинг пероксидазной активности плазмы во время клинических испытаний фармакологических препаратов. Простота и скорость предлагаемого способа обеспечивают возможность его использования в экспресс-диагностике. Способ осуществляется следующим образом. Для работы используют спектрофотометр, позволяющий регистрировать оптическую плотность в видимой области спектра. 2 17950 1 2014.02.28 Отделенную от клеточного осадка путем центрифугирования плазму крови в количестве 60-70 мкл вносят в спектрофотометрическую кювету объемом не менее 0,8 мл, содержащую ингибитор МПО - гидразид 4-аминобензойной кислоты (50 мкМ) и -дианизидин(380 мкМ) в фосфат-цитратном буфере с 5,5. После добавления 2 мМ пероксида водорода содержимое пробы (общий объем пробы 0,8 мл) быстро перемешивают непосредственно в кювете и начинают регистрацию увеличения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 460 нм в течение 8-10 мин. Оптическим контролем служит проба, содержащая те же компоненты, что и опытная проба, но вместо плазмы добавлен равный объем буферного раствора. Расчет пероксидазной активности гемоглобина,0,0152 где- прирост оптической плотности при 460 нм замин- общий объем реакционной смеси (мл)- объем образца плазмы (мл) 0,0152 прирост , соответствующий окислению 1 мкМ -дианизидина. Данный коэффициент определяли по калибровочной прямой зависимости оптической плотности при 460 нм от концентрации -дианизидина (25-150 мкМ) после его полного окисления пероксидазой хрена (0,1 мкг/мл) в присутствии пероксида водорода (2 мМ). Единица пероксидазной активности гемоглобина в плазме (ПА) выражена в условных единицах (далее усл. ед.) и соответствует окислению 1 мкМ -дианизидина за 1 мин в описанных условиях. Пример 1, демонстрирующий выбор оптимальногопри определении пероксидазной активности гемоглобина в плазме. В одну опытную кювету объемом 0,8 мл вносили 60 мкл плазмы, гемоглобин в концентрации 13,3 мкМ, фосфат-цитратный буфер (0,05 М 24/0,025 лимонная кислота) и субстрат -дианизидин (380 мкМ). В другую, все то же самое, за исключением гемоглобина. В контрольную кювету - те же компоненты, за исключением того, что вмесло плазмы вносили 60 мкл фосфат-цитратного буфера. Содержимое кювет тщательно перемешивали и одновременно в три кюветы добавляли раствор пероксида водорода (1 мМ). Содержимое кювет еще раз тщательно перемешивали и регистрировали оптическую плотность в опытных кюветах против контрольной пробы при длине волны 460 нм в течение 8-10 мин. Предлагаемым способом была измерена пероксидазная активность гемоглобина в плазме при различных значениях 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 и 7,0, что достигалось путем использования фосфат-цитратного буфера с указанными значениями . Пероксидазная активность гемоглобина в плазме рассчитывалась согласно формуле 0,8 ПА,0,01520,06 гдеи- прирост оптической плотности плазмы крови замин в присутствии и в отсутствие добавленного извне гемоглобина соответственно 0,8 - объем реакционной смеси (мл) 0,06 - объем плазмы в опытной пробе (мл). Результаты измерений приведены на фиг. 1, откуда следует, что зависимость пероксидазной активности гемоглобина в плазме отимеет максимум в диапазоне 4.5-5,5. Однако ранее было показано, что зависимость активности МПО относит экстремальный характер с максимумом при 4,5 и значительно снижается при 5,5. Поэтому анализ данных, приведенных на фиг. 1, позволяет сделать вывод о том, что значение 5,5 оптимально для измерения активности гемоглобина в плазме с минимальным вкладом активности МПО. Пример 2, демонстрирующий выбор оптимальной концентрации пероксида водорода при определении пероксидазной активности гемоглобина в плазме. 3 17950 1 2014.02.28 Определение пероксидазной активности гемоглобина в плазме проводили, как описано в примере 1, но при различных концентрациях пероксида водорода в диапазоне 1004000 мкМ. Использовали фосфат-цитратный буфер с 5,5. Результаты определения активности гемоглобина при разных добавках пероксида водорода приведены на фиг. 2, откуда следует, что пероксидазная активность гемоглобина в плазме практически линейно увеличивалась с ростом концентрации 22 вплоть до 2 мМ. Анализ этих данных позволяет сделать вывод о том, что концентрация пероксида водорода, равная 2 мМ, является оптимальной для определения пероксидазной активности гемоглобина. Пример 3. Предлагаемым способом измерена активность гемоглобина в плазме крови 5 человек. В опытную кювету объемом 0,8 мл вносили 60 мкл плазмы, фосфат-цитратный буфер(0,05 М 24/0,025 лимонная кислота,5,5), гидразид 4-аминобензойной кислоты в концентрации 50 мкМ и субстрат - -дианизидин (380 мкМ). Содержимое кюветы тщательно перемешивали и добавляли раствор пероксида водорода (2 мМ). Содержимое кюветы еще раз тщательно перемешивали и начинали регистрацию оптической плотности в опытной кювете против контрольной пробы при длине волны 460 нм в течение 8-10 мин. Оптическим контролем служила проба, содержащая те же компоненты, что и опытная проба, но вместо плазмы добавлен равный объем буферного раствора. Пероксидазная активность гемоглобина в плазме рассчитывалась согласно формуле 0,8,0,01520,06 где- прирост оптической плотности плазмы крови замин 0,8 - объем реакционной смеси (мл) 0,06 - объем плазмы в опытной пробе (мл). Полученные результаты приведены в таблице. Показатель пероксидазной активности гемоглобина в плазме Анализ данных, приведенных в таблице, позволяет сделать вывод о том, что предлагаемый способ пригоден для определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови. Таким образом, предлагаемый способ позволяет быстро и реально определить пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5