Способ определения эффективности химиоиммунотерапии больного хроническим лимфолейкозом

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХИМИОИММУНОТЕРАПИИ БОЛЬНОГО ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМФОЛЕЙКОЗОМ(71) Заявители Государственное учреждеи медицинских биотехнологий Учрежние Республиканский научно-пракдение здравоохранения 9-я городская тический центр трансфузиологии и клиническая больницамедицинских биотехнологий Учре- (56). , 2004. . 103. - . 6. - . 2027-2031. ждение здравоохранения 9-я городВИНОГРАДОВА Ю.Е. и др. Гематолоская клиническая больницагия и трансфузиология. - 2000. - Т. 45. (72) Авторы Морозова Оксана Михайлов 2. - С. 9-12. на Цвирко Дмитрий Геннадьевич 2014607 1, 1994. Смольникова Виктория Владимиров 1614659 1, 1995. на Маринич Дмитрий Викторович Миланович Наталья Феодосьевна Усс Анатолий Леонидович Змачинский Владимир Арнольдович(57) Способ определения эффективности химиоиммунотерапии больного хроническим лимфолейкозом, отличающийся тем, что до курса химиоиммунотерапии, в течение курса и на следующий день после его окончания определяют в периферической крови больного содержание клональных В-лимфоцитов и апоптотических-лимфоцитов с использованием шестицветной цитофлуориметрии и делают вывод о том, что химиоиммунотерапия эффективна при снижении содержания клональных В-лимфоцитов и увеличении содержания апоптотических-лимфоцитов на 5 или более в течение или после окончания курса химиоиммунотерапии по сравнению с их уровнем до начала курса химиоиммунотерапии. Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для оценки эффективности применения различных протоколов химиоиммунотерапии у больных хроническим лимфолейкозом. В связи с внедрением в клиническую практику такого высокоэффективного метода лечения хронического лимфолейкоза как химиоиммунотерапия, а также в связи с необходимостью ее совершенствования, особую актуальность приобрело применение в клинике высокочувствительных методов оценки противоопухолевого эффекта терапии. Известен способ оценки эффективности химиотерапии и прогнозирования ее результатов по снижению содержания в крови и костном мозге лейкозных клеток, в том числе 17629 1 2013.10.30 лимфоцитов при хроническом лимфолейкозе, определяемых с помощью цитоморфологического исследования при выполнении общего анализа крови и подсчета миелограммы 1. Недостатком известного способа является его низкая чувствительность и недостаточная специфичность, обусловленные невозможностью морфологически различить лейкемические и нормальные лимфоциты и достаточно высоким содержанием лимфоцитов в крови и костном мозге в норме (до 40 от всех лейкоцитов периферической крови и до 10 миелокариоцитов). Это делает невозможным контроль за динамикой популяций нормальных и лейкемических лимфоцитов на фоне химиотерапии и тем более выявление остаточных лейкемических лимфоцитов в морфологически нормальных крови и костном мозге (мониторинг минимальной остаточной болезни), а также прогнозирование длительной безрецидивной и общей выживаемости. Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату является способ оценки эффективности одного из протоколов химиоиммунотерапии(монотерапии алемтузумабом), базирующийся на контроле содержания в крови клональных В-лимфоцитов, определяемых с помощью стандартного метода четырехцветной проточной цитофлуориметрии 2. Недостатком способа является невысокая эффективность из-за невозможности раннего (в первые 3-5 дней) прогнозирования ответа на терапию (ответ оценивают по степени снижения содержания в крови клональных -лимфоцитов на второй-четвертой неделях лечения), а также его недостаточная чувствительность (1 клональный В-лимфоцит на 10000-100000 лейкоцитов). Информативность данного способа продемонстрирована только для одного протокола химиоиммунотерапии хронического лимфолейкоза - монотерапии алемтузумабом. Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в повышении эффективности способа для возможности ранней оценки результатов лечения,что необходимо для обоснованного выбора протокола лечения и своевременной его коррекции при отсутствии эффекта. Применение заявляемого способа позволит добиться максимально полной элиминации лейкозного клона и длительной безрецидивной и общей выживаемости пациентов. Задача решается за счет того, что в способе определения эффективности химиоиммунотерапии больного хроническим лимфолейкозом до курса химиоиммунотерапии, в течение курса и на следующий день после его окончания определяют в периферической крови больного содержание клональных В-лимфоцитов и апоптотических -лимфоцитов с использованием шестицветной цитофлуориметрии и делают вывод о том, что химиоиммунотерапия эффективна при снижении содержания клональных В - лимфоцитов и увеличении содержания апоптотических -лимфоцитов на 5 или более в течение или после окончания курса химиоиммунотерапии по сравнению с их уровнем до начала курса химиоиммунотерапии. Сущность изобретения иллюстрируется фигурами, где на фиг. 1 представлена динамика иммунофенотипических параметров у пациента Л.П.Н. по примеру 1, на фиг. 2 тоже у пациента Г.И.И. по примеру 2, на фиг. 3 - динамика относительного содержания-лимфоцитов, клональных -лимфоцитов и -лимфоцитов в периферической крови пациентов группы 1 на фоне химиоиммунотерапии, на фиг. 4 - динамика относительного содержания -лимфоцитов, клональных -лимфоцитов и -лимфоцитов в периферической крови пациентов группы 2 на фоне химиоиммунотерапии. Клональные -лимфоциты определяют с помощью шестицветной проточной цитофлуориметрии. Нормальные -лимфоциты имеют фенотип 19 5- 45 79 в 23- 20, тогда как клональные -лимфоциты при хроническом лимфолейкозе 19 5 45 23 79 в- 20 или 20- (в зависимости от первичного иммунофенотипа). Определение поверхностных маркеров клональных -лимфоцитов проводят методом прямого флуоресцентного окрашивания с использованием моноклональных антител 2, 23( ) 4. Учет проводят на проточном цитофлуориметрев рабочей программе. Для определения клональных -лимфоцитов используют постадийное гейтирование,выделяя сначала регион -лимфоцитов (4519), в котором определялся процент клональных и нормальных клеток. Для получения достоверных данных загрузку клеток в регион -лимфоцитов проводят в количестве от 1000 до 5000, при этом общее количество загружаемых клеток может достигать от 100000 до 1000000 (в зависимости от процента-лимфоцитов в исследуемом образце). Спонтанную и индуцированную химиоиммунотерапией апоптотическую активность опухолевых -лимфоцитов оценивают по экспрессии этими клетками аннексина,определяемого с помощью шестицветной проточной цитофлуориметрии 3. Для его определения к 100 мкл периферической крови добавляют моноклональные антитела 19, 3, 45 ( ) согласно прописи фирмы производителя и инкубируют 25 мин при комнатной температуре, затем эритроциты лизируют и дважды отмывают(0,01 М ,7,4, 0,14, 2,52), инкубируют в 100 мклс моноклональными антителами к 15 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации добавляют 400 мкл. Учет проводят из 50000 клеток на проточном цитофлуориметрес использованием двух лазеров возбуждения 488 нм и 630 нм в рабочей программе . Результат проведения протокола химиоиммунотерапии оценивают по повышению относительного содержания в крови(апоптотических) -лимфоцитов в сравнении с исходным уровнем и снижению относительного содержания -лимфоцитов, в том числе клональных, на фоне терапии. До начала проведения протокола химиоиммунотерапии ежедневно в течение трех первых дней и после окончания протокола методом шестицветной проточной цитофлуориметрии определяют относительное содержание в периферической крови -лимфоцитов, в том числе клональных и экспрессирующих . В случае увеличения относительного содержания(апоптотических) -лимфоцитов на 5 и более в сравнении с исходным (до начала терапии) уровнем и/или снижения относительного содержания -лимфоцитов (также в сравнении с исходным уровнем) на первом курсе лечения проводят второй курс химиоиммунотерапии (с соблюдением требуемых временных интервалов между курсами), определяя описанные выше иммунофенотипические параметры аналогично первому курсу. В случае сохранения или нарастания относительного содержания-лимфоцитов и/или дальнейшего снижения относительного содержания В-лимфоцитов, и/или снижения относительного содержания клональных -лимфоцитов по результатам исследования на втором курсе лечения проводят очередные курсы химиоиммунотерапии с контролем иммунофенотипических параметров до достижения полной клинико-гематологической и иммуно-фенотипической ремиссии. В случае отсутствия повышения относительного содержания-лимфоцитов и снижения относительного содержания -лимфоцитов в течение первого курса терапии проведение химиоиммунотерапии по данному протоколу прекращают и меняют протокол лечения. В случае отсутствия снижения относительного содержания клональных -лимфоцитов в течение либо после третьего курса терапии проведение химиоиммунотерапии по данному протоколу прекращают, меняют протокол лечения. Пример 1. Пациент Л.П.Н. Диагноз хронического лимфолейкоза, стадия , был верифицирован клинически, морфологически, иммунофенотипически. В качестве терапии был выбран протокол иммунохимиотерапиипосле эскалации начальной дозы алемтузумаб 3 17629 1 2013.10.30 вводили по 30 мг подкожно 3 дня подряд, флюдарабин 30 мг/м 2 внутривенно 3 дня подряд. Через 21 день провели второй курс терапии по схеме . При повторном курсе терапии эскалацию дозы алемтузумаба не проводили и препарат вводили в полной дозе (30 мг). У данного пациента отсутствовали повышение относительного содержания-лимфоцитов в крови, а также снижение относительного содержания клональных -лимфоцитов в течение первого и второго курсов терапии (фиг. 1). Отсутствие положительной динамики иммунофенотипических параметров соответствовало клинической картине у пациента в течение двух курсов химиоиммунотерапии по схемене отмечалось уменьшения общего количества лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови, не отмечалось также уменьшения размеров лимфоузлов уровень лейкоцитов перед первым курсом терапии - 65,5109/л, лимфоцитов - 64,2109/л, после проведенного лечения уровень лейкоцитов составлял 67,6109/л, лимфоцитов 65,6109/л, после второго курса терапии уровень лейкоцитов составлял 70,7109/л, лимфоцитов - 67,9109/л. Проведение химиоиммунотерапии по данному протоколу прекратили, изменили протокол лечения. Пример 2. Пациент Г.И.И. Диагноз хронического лимфолейкоза, стадия , был верифицирован клинически, морфологически, иммунофенотипически. Пациенту проводили лечение по протоколуритуксимаб 375 мг/м 2 внутривенно (первый курс) и 500 мг/м 2 в течение последующих (2-6) курсов, флюдарабин 20 мг/м 2 внутривенно 3 дня, циклофосфамид 150 мг/м 2 внутривенно 3 дня, интервал между курсами составлял 28 дней. У данного пациента имело место повышение относительного содержания-лимфоцитов до 34,73(с первого курса), а также наблюдалось значительное снижение относительного содержания В-лимфоцитов в течение всех курсов терапии (фиг. 2). Наличие положительной динамики иммунофенотипических параметров соответствовало клинической картине у пациента уже после двух курсов химиоиммунотерапии по схеменормализовался уровень лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови. Уровень лейкоцитов до лечения 95,810 , лимфоцитов - 87,4109/л после первого курса терапии лейкоциты 46,5109/л, лимфоциты 42,6109/л перед вторым курсом терапии лейкоциты 6,07109/л, лимфоциты 4,89109/л после проведенного второго курса лейкоциты 4,2710 , лимфоциты 2,1110 . У данного больного после шести курсов химиоиммунотерапии получена полная клинико-гематологическая и иммунофенотипическая ремиссия. Заявляемым способом оценивали эффективность различных протоколов химиоиммунотерапии у пациентов с хроническим лимфолейкозом. Пациенты получали различные варианты химиоиммунотерапии монотерапию алемтузумабом и ритуксимабом, сочетания указанных препаратов с флюдарабином, циклофосфамидом, лейкладином. Среди пролеченных пациентов выделили две группы в соответствии с клинико-гематологическими и иммунофенотипическими параметрами их ответа на терапию группа 1 - отсутствие клинико-гематологического и иммунофенотипического (отсутствие снижения относительного содержания В-лимфоцитов, в том числе клональных) ответа (6 пациентов, 43 исследования) группа 2 - полный клинико-гематологический и полный иммунофенотипический (все-лимфоциты неклональны) ответ (5 пациентов, 77 исследований). Результаты представлены в виде динамики усредненных внутри группы параметров,соответствующих дням исследования и курсам терапии (фиг. 3, 4). На фиг. 3 (в группе 1) видно отсутствие стимуляции апоптоза -лимфоцитов и снижения их относительного содержания в крови на первом курсе терапии, а также отсутствие снижения относительного содержания клональных -лимфоцитов на протяжении всех четырех курсов терапии. У пациентов данной группы отсутствовала также положительная клиническая динамика на фоне лечения. На фиг. 4 (в группе 2) отражены выраженная стимуляция апоптоза -лимфоцитов и снижение их относительного содержания в крови на первом курсе терапии, а также сни 4 17629 1 2013.10.30 жение относительного содержания клональных В-лимфоцитов со второго курса (недели) терапии вплоть до полной их элиминации к началу пятого курса (недели) лечения. У пациентов данной группы достигнуты полная клинико-гематологическая и полная иммунофенотипическая ремиссия. Источники информации 1..-. . - 1996. . 12. - . 4990-4997. 2... . - 2004. - . 15. - . 103(6). - . 2027-2031. 3. , ., . ,. ... - 2001. - . 38. - . 179-193. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6