Штамм Salmonella enteritidis КМИЭВ-В 116 – штамм-антиген

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Учреждение образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины(72) Авторы Лагун Наталья Викторовна Машеро Владимир Александрович(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины(56)2218177 С 2, 2003.2177804 С 2, 2002.2232808 С 1, 2004. ДАРОВСКИХ С.В. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины. 2006. Т. 42. Вып. 2. Ч. 1. - С.66-69. АНДРОСИК Н.Н. и др. Эпизоотология. Иммунобиология. Фармакология. Санитария. - 2008. -1. - С.23-28. ГНЕВАШЕВ В. Ветеринария сельскохозяйственных животных. - 2008.11. - С.24-25.(57) Штамм бактерийКМИЭВ-В 116 - штамм-антиген для изготовления вакцины или диагностического препарата. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и касается штамма, выделенного от теленка, больного сальмонеллезом, обладающего антигенной активностью, который может быть использован для конструирования диагностических и профилактических препаратов при упомянутой болезни. Сальмонеллез, вызываемый штаммом, регистрируется во многих странах мира. В последнее десятилетие данное заболевание является серьезной экономической и социальной проблемой 1. Известны штаммы бактерий вида, населяющие желудочнокишечный тракт животных и человека 2. Эндотоксины патогенного штаммаиграют роль сенсибилизаторов, способствуя более быстрому проникновению сальмонелл в лимфу и кровеносную систему. Эндотоксины, являющиеся по своему составу глицидо-липоидо-полипептидным комплексом, вызывают нарушение терморегуляции, серозное воспаление паренхиматозных органов, генерализованный паралич вазомоторов путем воздействия на сосудистонервный аппарат и непосредственно на нервные центры 3, 4. Известен штамм 22, концентрация микробных клеток которого при выращивании составляет 40-50 млрд. по стандарту мутности К.А.Тарасевича. Вирулентные свойства 50 для белых мышей внутрибрюшинно составила 2,4106 живых мик 15676 1 2012.04.30 робных клеток. Патогенен для новорожденных телят. При пероральном заражении в дозе 10 млрд. м.к. через 24 часа наблюдают диарею, на 2-3-и сутки - гибель животного 5. Известен штамм 204-. Штамм устойчив к стрептомицину, рифампицину, триметоприму. Вирулентность (50) для белых мышей - 5,6106 микробных клеток. Иммуногенность выживаемость белых мышей и цыплят, иммунизированных аттенуированным штаммом, после заражения 5 50 вирулентного штамма составляет 8095 от числа зараженных животных, при гибели в контроле - 90-1005. Все штаммы родаобладают идентичными культурально-морфологическими свойствами. Вместе с тем бактерии проявляют вариабельность в биохимическом отношении, а также в отношении чувствительности к антибиотикам, обладают различной вирулентностью, иммуногенностью 6, 7. Некоторые штаммычувствительны к следующим антибиотикам ампициллину, сульбактану, амоксициллину, цефотаксину, цефтриаксону, тетрациклину,ципрофлоксацину, котримоксазолу 8, 9. Сальмонеллы растут на всех простых питательных средах. На мясопептонном агаре они образуют сочные серо-белые с голубоватым оттенком колонии, а при росте на бульоне вызывают его интенсивное помутнение с образованием на дне обильного серо-белого осадка. На среде Эндо бактерии образуют колонии слегка голубоватые или розовые, на среде Левина - колонии прозрачные, иногда с голубоватым оттенком, на висмутсульфитном агаре - с металлическим блеском 10, 11. Сальмонеллы не ферментируют лактозу, сахарозу, салицин, адонит, не расщепляют мочевину, не дают реакции Фогес-Проскауера, многие способствуют образованию сероводорода, вызывают образование индола. Штаммы сальмонелл проявляют широкую вариабельность биохимических свойств в отношении многих углеводов и многоатомных спиртов. При сбраживании углеводов образуется пируват, превращающийся в молочную,уксусную и муравьиную кислоты. Глюкоза, лактоза, маннит сбраживаются с образованием кислоты и газа. Сахароза и дульцит ферментируются непостоянно. Большинство штаммов сбраживает лактозу 12, 13, 14. Биохимическая активность у сальмонелл различных видов варьируется.отличается от других видов сальмонелл тем, что данный штамм ферментирует глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу, арабинозу, не разлагает лактозу и сахарозу. При определении сахаролитической активности бактерии данного вида дают положительную реакцию с метиленовым красным и отрицательную Фогеса-Проскауера. На агаре Клигера выделяют сероводород, что проявляется образованием черного пятна и нарушением целостности среды. Выделенная культура утилизирует цитрат натрия на агаре Симмонса, окрашивая среду в синий цвет, не образует уреазу, индол. При посеве на полужидкий агар бактерии растут по всему объему среды, что указывает на подвижность выделенной культуры 15. Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, являлось выделение патогенного штамма, циркулирующего среди животных в хозяйствах Республики Беларусь, обладающего высокой иммуногенностью, пригодного для конструирования препаратов для диагностики и профилактики сальмонеллеза. Поставленная задача достигнута тем, что из большого количества штаммовбыл отобран штамм, изолированный в 2008 г. в СПК Вишневка, Минского района, Минской области, из органов теленка 2-месячного возраста с признаками сальмонеллеза. В результате отбора и проведения исследований был селекционирован штамм(КМИЭВ-В 116), отличающийся высокой иммуногенностью. Типичность изолированного штамма установлена с помощью наборов сывороток сальмонеллезных -комплексных и монорецепторных - и -агглютинирующих для экспресс-идентификации сальмонелл по реакции агглютинации (РА) на стекле. 15676 1 2012.04.30 Штамм бактерий(КМИЭВ-В 116) - штамм-антиген депонирован в коллекции РНИУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского Национальной академии наук Беларуси. Данный штамм используют в составе поливалентной концентрированной формолквасцовой вакцины, которую применяют для профилактики сальмонеллеза телят. Таксонометрическая принадлежность. Согласно определителю бактерий Берджиотносится к 5-й группе факультативно анаэробных грамотрицательных палочек,подгруппе 1 - семейство , роду , виду. Культурально-морфологические признаки.в мазках, приготовленных из бульонных и агаровых культур, окрашенных по Граму, имеет вид палочек с закругленными концами размерами (1-4)0,5 мкм, располагающихся одиночно и беспорядочно, бактерии обладают подвижностью. Бактерии являются факультативными анаэробами. Растут на питательных средах(МПА, МПБ, висмут-сульфитном агаре, селенитовой среде и среде Эндо). В МПА на 2-й день культивирования образуют серо-белые, кажущиеся голубоватыми в тонком слое среды, сочные, полупрозрачные, округлые колонии (1-2 мм в диаметре). В МПБ сальмонеллы вызывают его помутнение, на дне пробирок появляется серо-белый обильный осадок. На агаре Эндо бактерии формируют светло-розовые колонии, на висмут-сульфитном агаре вырастают черные колонии с характерным металическим блеском. Биохимические свойства. На средах, содержащих углеводы и многоатомные спирты,штамм бактерий(КМИЭВ-В 116) ферментирует глюкозу, лактозу,маннит, сорбит, арабинозу, мальтозу, ксилозу, маннозу, дульцит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол, не образует сероводород не разжижает желатину, не утилизирует цитраты, дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра, подвижен. Антигенный состав. Штамм относится к серотипу , группа 1. Агглютинируется комплексными сыворотками по -антигену (1 и 5 комплекс) 9, 12 и монорецепторными сыворотками по -антигенуи . Чувствительность к антибиотикам. Штамм чувствителен к кобоктану, окситетрациклину, гентамицину, каномицину, амикацину, метилмецину, цефуроксиму, цефазолину,цефтазидиму, цефаликсиму, карбенциллину, левомицетину, цефалотину, офлоксацину,ампициллину, полимиксину, ципрофлоксацину, фурадонину, стрептомицину, гентамицину, цефтриаксону. Патогенен для телят в возрасте от 10 до 34 дней. При пероральном заражении в дозе 10 млрд. м.к. у телят наблюдается на второй день ухудшение общего состояния и диарея,на восьмой день - гибель. Вирулентность. Для определения 50 использовали формулу Рида-Менча. Д 50 для белых мышей составила 534701,9 микробных клеток. Иммуногенность. Выживаемость белых мышей, иммунизированных штаммом, после заражения 5-7 ЛД 50 вирулентного штамма составляет 85-96 от числа зараженных животных. Гибель в контроле составила 95-100 . Пример 1. Для выделения штамма(КМИЭВ-В 116) - штамма-антигена патологический материал засевали в пробирки с МПА, МПБ. Оптимальная температура инкубирования 37 С в термостате и составляет 18-24 ч. На следующий день необходимо сделать высевы на плотные дифференциальные среды Эндо, Левина, Плоскирева и висмут-сульфитный агар. На МПА в первые сутки роста образуются округлые колонии средней величины сероватого цвета с голубоватым оттенком в тонком слое среды. МПБ мутнеет, впоследствии на дне пробирки образуется осадок. На агаре Эндо сальмонеллы имеют вид светлорозовых колоний, на висмут-сульфитном агаре вырастают черные колонии с характерным 15676 1 2012.04.30 металлическим блеском. На среде Плоскирева колонии бесцветны. На среде Левина - прозрачные. Пример 2. Для первичной идентификации выращенную культуру проверяли на чистоту роста микроскопией мазков. Культура должна иметь типичный рост на питательных средах и морфологию бактериальных клеток, характерную для .(в мазках). Далее необходимо проведение идентификации выделенной культуры по биохимическим свойствам на цветном ряду. Пример 3. Для серологической идентификации штамма(КМИЭВ-В 116) штамма-антигена применяют набор сывороток сальмонеллезных -комплексных и монорецепторных - и -агглютинирующих для экспресс-идентификации сальмонелл в реакции агглютинации на стекле. Первоначально культуру испытывают с -комплексными сыворотками. Для этого РА на стекле ставят с каждой из комплексных сывороток последовательно, начиная с первой, до получения положительного результата с двумя сыворотками. Серогрупповую принадлежность сальмонелл устанавливают по результатам РА. При необходимости разделения серогрупп 1 и 4, 2 и 3, 1 и 2, 2 и Е 3 проводят дополнительное исследование этих культур с монорецепторными -сыворотками. Для определения серовара сальмонеллы, отнесенные к определенной серогруппе, испытывают с моносыворотками 1 и 2 фазы. В выборе сывороток для реакции исходят из антигенной структуры сальмонелл той группы, к которой отнесена определяемая культура, с учетом вида животных, от которых она выделена. Антиген для серологических реакций готовят по следующей методике испытуемую культуру, выращенную на скошенном МПА при температуре 37-38 С в течение 18-24 часов. Постановка реакции каплю диагностической сыворотки наносят на стекло. Бактериологической петлей в нее вносят 20-24-часовую испытываемую агаровую культуру сальмонелл. Причем для РА с -сыворотками культуру берут с верхней части агара, с -сыворотками - с нижней части агара, вблизи конденсационной жидкости, и тщательно растирают с сывороткой. Реакцию учитывают визуально при легком покачивании стекла при температуре 18-28 С. При появлении мелкозернистого осадка или хлопьев различной величины с полным или частичным просветлением сыворотки реакция считается положительной. Культура на МПА, давшая положительную реакцию агглютинации с О-комплексными монорецепторными - и -агглютинирующими сыворотками и имеющая типичные для сальмонелл морфологические, тинкториальные и культуральные свойства, дальнейшему исследованию не подвергается и считается возбудителем сальмонеллеза с соответствующим антигеном. Периодичность пересева нативные - через 3-6 месяцев, замороженные или лиофилизированные - через 2-5 лет. Срок хранения 10 лет. Пример 4. Вирулентность определяли путем заражения 25 белых мышей 35-дневного возраста живой массой 16-18 грамм, разделенных на 5 групп, по 0,5 мл суточной бульонной культурой возбудителя с концентрацией 109 микробных клеток в 1 мл. Животным каждой группы вводили внутрибрюшинно по 0,5 мл микробной взвесииз разведений 10-3, 10-5, 10-7, 10-9, 10-11. За лабораторными животными наблюдали в течение 15 дней после инфицирования, делая посевы на питательные среды с целью выделения чистой культуры возбудителя. Для определения 50 использовали метод Рида-Менча. 50 выделенной культурысоставляет 534701,9 микробных клеток. Пример 5. Определение иммуногенных свойств. Штамм(КМИЭВ-В 116) штамм-антиген. Штамм культивировали на агаровой питательной среде, далее смывали 4 15676 1 2012.04.30 стерильным физраствором, доводя до концентрации 10 млрд. микробных клеток в 1 мл. Инактивировали формалином в конечной концентрации 0,4 в качестве адъюванта добавляли 10 алюмокалиевые квасцы в количестве 10 к объему. Далее двукратно, с интервалом 7 дней, иммунизировали белых мышей. Для этого 10 белым мышам штаммантиген вводили подкожно в дозе 0,3 мл. Напряженность иммунитета проверяли через 1014 дней после повторной вакцинации путем внутрибрюшинного заражения 10 вакцинированных и 10 контрольных животных 18-часовой смесью бульонной культуры штамма(КМИЭВ-В 116) - штамма-антигена в тест-дозе 0,5 мл. Штаммантиген считали иммуногенным, если в опытной группе в живых оставалось не менее 8596 животных, при гибели контрольных 95 и более животных в течение 10 суток после заражения. Таким образом, получен штаммс регистрационным номером КМИЭВ-В 116, депонированный в РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского - штамм-антиген, пригодный для конструирования диагностических и профилактических препаратов, обладающий высокой иммуногенностью и широким спектром устойчивости к антибиотикам. Источники информации 1. Андросик Н.Н., Локтева О.Н. Основные свойства сальмонелл, выделенных от телят,и результаты отбора штаммов для производства инактивированной вакцины против сальмонеллеза // Эпизоотология. Иммунобиология. Фармакология. Санитария. - 2008. -1. С. 23-28. 2. Гневашев В. Профилактика и меры борьбы с сальмонеллезом животных // Ветеринария сельскохозяйственных животных. - 2008. -11. - С. 24-25. 3..,С.,.,.-//. - 1997. - . 39 (1)85-7. 4../ . ,,//. - 1997. - . 41. - . 732-737. 5. Патент РФ 2218177 2, МПК 61 39/112, 2002. 6. Даровских С.В. Биологические свойства бактерий, изолированных от телят сборник научных трудов // Ученые записки Сб. научных трудов. Научно-практический журнал. Витебская государственная академия ветеринарной медицины/ Под ред. А.И.Ятусевич и др. - Витебск УО ВГАВМ, 2006. - Т. 42. - Вып. 2. - Ч. 1 (июльдекабрь). - С. 66-69. 7. Куриленко А.Н., Крупальник В.Л., Пименов Н.В. Бактериальные и вирусные болезни молодняка сельскохозяйственных животных Учебное пособие для студентов вузов по спец. Ветеринария. - М. КолосС, 2005. - 296 с. 8..,(2001-2002).//. - 2004. - . 53 - . 266-270. 9..,.,// . . , . . - 1999. - . - 112. - .2. . 41-43. 10. Вербицкий А.А. и др. Лабораторная диагностика бактериальных инфекций домашних животных учебно-методическое пособие для студентов по спец. Ветеринарная медицина и слушателей ФПК. Витебская государственная академия ветеринарной медицины. - Витебск УО ВГАВМ, 2006. - С. 136. 15676 1 2012.04.30 11. Пустовар А.Я. и др. Критерии лабораторной диагностики сальмонеллеза с.х. животных // Вет. медицина / н-т експерим.клнч. вет. медицини УА-АН. - 2000. - Вип. 78. Т. 1. - С. 256-262. 12. Ленев С.В., Малахов Ю.А., Шорохов В.В. Профилактика и диагностика сальмонеллеза сельскохозяйственных животных Сб. научн. трудов / Всероссийский гос.НИИ контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов - Центр качества ветеринарных препаратов и кормов. - М., 2001. - Т. 62. - С. 52-57. 13. Олйник Л. Серологчна спордненность сальмонелл, видлених вд людей та тварин // Вет. медицина Украни. - 2002. -4. -. С. 14-15. 14..,// . . 1997. -. 141. - . 12. - .297-299. 15. Дика О., Ивченко В. Сальмонельоз телят // Вет. медицина Украни. - 1996. -4. С. 14-15. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6