Способ оценки чувствительности опухоли к химиотерапии у больной метастатическим раком молочной железы

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОПУХОЛИ К ХИМИОТЕРАПИИ У БОЛЬНОЙ МЕТАСТАТИЧЕСКИМ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н.Александрова(72) Авторы Жаврид Эдвард Антонович Антоненкова Нина Николаевна Прохорова Виолетта Игоревна Лаппо Светлана Владимировна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н.Александрова(56) Минимальные клинические рекомендации европейского общества медицинской онкологии . - Москва,2008. - С. 25-37. ШЕВЦОВА Г.Н. Морфо-биологические маркеры (, интерлейкин-6 -67) при раке молочной железы и их связь с прогнозом заболевания Автореферат диссертации. Москва, 2002. - С. 10-12, 29-39. КИМ Е.А. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. - Т. 145,2. - С. 206-209. КИМ Е.А. и др. // Вопросы онкологии. 2008. - Т. 54,3. - С. 287-293. СЕМЕНОВА Н.А. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2000. - Т. 130,7. - С. 102-105.2341198 2, 2008.2094802 1, 1997.2099703 1, 1997.(57) Способ оценки чувствительности опухоли к химиотерапии у больной метастатическим раком молочной железы, отличающийся тем, что до и после двух курсов химиотерапии определяют концентрацию сосудистого эндотелиального фактора ростав сыворотке крови и по значению концентрацииоценивают чувствительность опухоли к химиотерапии, при этом повышение концентрациипосле химиотерапии более чем на 20 пг/мл указывает на прогрессирование опухолевого процесса, снижение концентрацииболее чем на 20 пг/мл - на регрессию опухолевого процесса, а отсутствие изменений концентрации- на стабилизацию опухолевого процесса. Изобретение относится к области медицины, а именно к онкомаммологии, и может быть использовано для оценки чувствительности опухоли к химиотерапии у больной метастатическим раком молочной железы (РМЖ). В клинической практике чувствительность опухоли к проводимому лечению у больной раком молочной железы оценивается по данным маммографии, ультразвукового исследования, рентгенографии, компьютерной, магниторезонансной томографии,15575 1 2012.02.28 остеосцинтиграфии и др. Вышеперечисленные способы не всегда высокоинформативны,поскольку не позволяют оценить изменения, происходящие в организме. В настоящее время определение уровней опухолевых маркеров широко используется в диагностике, при мониторинге состояния онкологических больных и для доклинического выявления рецидивов заболевания. К опухолевым маркерам относится большая группа биологически активных веществ, концентрация которых в сыворотке зависит от развития злокачественного процесса. Они представляют собой макромолекулы, в основном белки с углеводными или липидными компонентами. Часть опухолевых маркеров секретируется в кровь, благодаря чему их концентрацию можно определить с помощью иммуноферментного анализа. В настоящее время известно около 200 соединений, относящихся к опухолевым маркерам при различных локализациях рака, однако диагностическую значимость имеют только несколько онкопротеинов. Наиболее диагностически значимыми являются простат-специфический антиген при раке предстательной железы, раково-эмбриональный антиген при раке толстой кишки,карбогидратный антиген СА-153 при раке молочной железы, -125 при раке яичников,-хорионический гонадотропин при хорионкарциноме и альфа-фетопротеин при герминогенных опухолях. Учитывая, что важную роль в развитии злокачественных новообразований играют факторы роста, стимулирующие развитие новых сосудов в опухоли, внимание в последние годы уделяют исследованию содержания сосудистого эндотелиального фактора роста в биологических средах.- один из членов семейства структурно близких между собой белков, которые являются лигандами для семейства рецепторов . Сосудистый эндотелиальный фактор роста влияет на развитие новых кровеносных сосудов (ангиогенез) и выживание незрелых кровеносных сосудов, связываясь с двумя близкими по строению мембранными тирозинкиназными рецепторами (рецептором-1 и рецептором-2 ) и активируя их. Эти рецепторы экспрессируются эндотелиальными клетками кровеносных сосудов. Связываниес этими рецепторами запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост клеток эндотелия сосуда, их пролиферацию. Эндотелиальные клетки участвуют в таких разнообразных процессах, как вазоконстрикция и вазодилатация, презентация антигенов, а также служат очень важными элементами всех кровеносных сосудов (капилляров, вен и артерий). Таким образом, стимулируя эндотелиальные клетки, играет центральную роль в процессе ангиогенеза. Экспрессиястимулируется множеством проангиогенных факторов, включая эпидермальный фактор роста, основной фибробластный фактор роста, тромбоцитарный фактор роста и интерлейкин-1. Кроме того, уровнинепосредственно регулируются такими факторами окружающей среды, как , давление и концентрация кислорода. Общее влияние этих различных факторов заключается в опосредованной черезстимуляции важных для ангиогенеза факторов, включая антиапоптотические белки, молекулы клеточной адгезии и металлопротеиназы. Все эти процессы потенциально важны для патогенеза злокачественных новообразований. В отсутствие сосудистой сети опухоли остаются мелкими (1-2 мм). Злокачественные опухоли подвергаются ангиогенному переключению, что нарушает баланс между про- и антиангиогенными факторами обычно благодаря усилению секреции факторов роста. Многие онкопротеины, а также низкийи низкие концентрации кислорода, обнаруживающиеся в опухоли, стимулируют экспрессию , который затем активирует экспрессию других звеньев ангиогенеза, таких как металлопротеиназы и молекулы клеточной адгезии. Тем самымдействует как ключевой медиатор опухолевого ангиогенеза,стимулируя рост новых кровеносных сосудов из близлежащих капилляров и давая опухо 2 15575 1 2012.02.28 ли доступ к кислороду и питательным веществам, в которых она нуждается для своего роста и метастазирования. При многих видах опухолей усиление экспрессиикоррелирует с неблагоприятным прогнозом, в том числе с агрессивным ростом опухоли, рецидивами, метастазированием и уменьшением выживаемости больных. Кроме того, экспрессиякоррелирует с повышением плотности микрососудистой сети в опухоли, что само по себе служит индикатором прогноза при различных онкологических заболеваниях 1. Однако следует отметить, что в литературе не встречалось работ, позволяющих оценить лечебный эффект в динамике по определению концентрации . В этой связи актуальным остается поиск высокочувствительных диагностических способов, которые позволят оценить чувствительность опухоли к химиотерапии у больных с метастатическим раком молочной железы. Известен способ оценки чувствительности опухоли к химиотерапии у больной раком молочной железы с помощью маммографии - рентгеновского исследования молочной железы 2. Маммография позволяет определить наличие изменений в тканях молочной железы и оценить их размеры, характер, распространенность. Однако у больных, у которых возврат болезни наступил после ранее проведенного радикального лечения, этот способ не приемлем. Иногда при маммографическом исследовании опухолевые изменения не определяются в толще ткани железы. Такие результаты маммографии называются ложноотрицательными. В связи с этим для оценки чувствительности опухоли к проводимому лечению необходимо сочетать маммографическое исследование с другими способами диагностики. Таким образом, маммография не является идеальным способом диагностики и оценки лечебного эффекта при данной форме заболевания. Еще существенным недостатком данного способа является рентгеновское излучение, которое не безопасно для здоровья больной. Известен способ оценки чувствительности опухоли к химиотерапии у больной раком молочной железы с метастатическим поражением костей по результатам остеосцинтиграфии 3. С помощью этого способа оценивают интенсивность деструктивно-репаративных процессов в костной ткани. Сущность способа состоит в том, что больной раком молочной железы внутривенно вводят радиофармпрепарат - технеций. Этот изотоп обладает свойством избирательно накапливаться в тканях (ткани, пораженные опухолью, накапливают препарат более интенсивно в сравнении со здоровыми). Однако данный способ также имеет недостатки - не всегда информативен и для подтверждения метастического поражения костей необходимо выполнение рентгенографии областей скелета, в которых зафиксировано патологическое накопление радиофармпрепарата, - метод не безопасен для здоровья больной при использовании его с целью оценки лечебного эффекта чаще 1 раза в 6 месяцев. Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ оценки чувствительности опухоли к химиотерапии у пациенток, раком молочной железы по уровню изменений концентраций опухолеассоциированного антигена -153 4. Данный способ принят нами в качестве прототипа. Суть способа состоит в определении концентрации опухолеассоциированного антигена -153 в сыворотке крови больной раком молочной железы до начала лечения и в процессе химиотерапии. Исследование уровня в сыворотке крови данного онкопротеина используют для мониторинга и эффективности химиотерапии. Два последовательных повышения концентраций маркера в сыворотке крови указывают на прогрессирование заболевания и служат основанием для прекращения проводимой терапии или ее изменения. После начала химиотерапевтического лечения может отмечаться временное повышение уровня-153 в сыворотке, достигающее пика и заканчивающееся в течение 6-12 недель после начала терапии. Увеличивающаяся концентрация-153 в сыворотке крови может 15575 1 2012.02.28 указывать и на развитие отдаленных метастазов у больных раком молочной железы без соответствующих клинических симптомов. Вместе с тем прототип имеет следующие недостатки не существует единого мнения о клинически значимом повышении концентрации 153 при раке молочной железы маркер -153 не является определяющим фактором при оценке чувствительности опухоли к химиотерапии у больной раком молочной железы. Задача разработать высокоинформативный способ оценки чувствительности опухоли к химиотерапии у больной метастатическим раком молочной железы. Решение поставленной задачи достигают тем, что у пациентки, метастатическим раком молочной железы до начала проведения химиотерапии и после двух ее курсов определяют в сыворотке крови концентрации сосудистого эндотелиального фактора роста и по его значению оценивают чувствительность опухоли к химиотерапии. Способ осуществляют следующим образом. У пациентки с РМЖ берут венозную кровь. Венозная кровь, полученная в пробирки без антикоагулянтов (можно использовать вакуумные пробирки с красными крышками),остается при комнатной температуре 15-25 С в течение 30 минут до полного образования сгустка. После ретракции сгустка пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут при комнатной температуре 15-25 С. После центрифугирования отбирают сыворотку крови. Образцы могут храниться в холодильнике при температуре 2 -8 С не более суток. Для более длительного хранения образцы необходимо заморозить (20 - 70 С). Чем больше срок хранения образца, тем ниже должна быть температура. Многократное замораживание и оттаивание недопустимо. После оттаивания ( 37 С в водяном термостате) пробирку с пробой нужно тщательно перемешать до достижения гомогенности раствора. Образцы не должны содержать видимых глазом включений, нитей, агрегатов такие образцы следует предварительно центрифугировать. Исследование концентрациив сыворотке крови проводят с помощью стандартных наборов для иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией производителя. Принцип используемого способа основан на неконкурентном гетерогенном иммуноферментном анализе для определения антител и антигенов методом сэндвич. При определении антител в качестве иммуносорбента выступает антиген. На твердой поверхности пластиковой лунки (микропланшета) сорбированы антитела,специфичные для определения . В лунку вносят сыворотку крови больной. Исследуемый антиген связывается в ходе инкубации с антителом, сорбированным на планшете. Несвязывающиеся компоненты удаляют отмыванием. В лунку вносят конъюгат, который представляет собой антитело, меченое ферментом. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии процесса иммунные комплексы, то конъюгат соединяется с определенными антигенами и образуется тройной комплекс - сэндвич. Несвязавшаяся часть конъюгата остается в жидкой фазе и удаляется отмыванием. В лунку добавляют субстратно-хромогенный реагент, который под влиянием фермента конъюгата превращается в окрашенный продукт реакции. Количество тестируемых антигенов оценивают по измерению оптической плотности окрашенного продукта реакции при длине волны 450 нм. Строят калибровочную зависимость и проводят определение концентрации тестируемых антигенов в крови больной. Концентрация определяемого вещества прямо пропорциональна интенсивности окраски пробы и, следовательно, измеренной оптической плотности. Диапазон референтных значений по коммерческим наборам длясоставляет 40-500 пг/мл (среднее значение - 270 пг/мл). В соответствии с рекомендациями компаниипроизводителя каждая лаборатория устанавливает свои собственные референтные значения исследуемого показателя. 15575 1 2012.02.28 В РНПЦим. Александрова для исследования концентрациив сыворотке крови используют коммерческие наборы( ,. ). Измерения производят на автоматическом анализаторе - . Определение концентрациипроводят в динамике у больных РМЖ. Референтные значения содержанияв сыворотке крови получены в результате обследования 30 клинически здоровых женщин в возрасте 30-65 лет. Стандартные образцы, образцы для контроля качества, образцы сыворотки крови клинически здоровых лиц и больных РМЖ до и после химиотерапии помещают в лунки микропланшета, на поверхности которых сорбированы антитела, специфичные для определения . Инкубируют 2 часа при комнатной температуре и постоянном встряхивании. Затем в лунки вносят биотилированные моноклональные антитела и стрептаведин пероксидазу хрена и вновь инкубируют 2 часа при комнатной температуре. После каждого этапа инкубации проводят 4-кратную отмывку буфером. Ферментную активность пероксидазы измеряют в присутствии. Через 30 минут после добавленияреакцию останавливают стоп-раствором. Измерение проводят на автоматическом ридере при длине волны 450 нм. Расчет концентрациив сыворотке крови проводят по калибровочной кривой и выражают в пг/мл. В результате проведенного нами исследования установлено, что диапазон референтных значений длясоставляет от 12,2 до 350,0 пг/мл (среднее значение 141,015,1 пг/мл). У пациенток с метастатическом раком молочной железы исходный уровеньв сыворотке крови составляет от 280 до 443,1 пг/мл. После проведенных двух курсов химиотерапии у части больных концентрацияв сыворотке крови снижается, у других повышается или практически не изменяется. После проведенной математической обработки установлено, что о прогрессировании опухолевого процесса в процессе лечения свидетельствует повышение уровняболее чем на 20 пг/мл, уменьшение более чем на 20 пг/мл - о регрессии, неизменившаяся концентрацияпозволяет судить о стабилизации заболевания. Основными отличительными признаками заявляемого способа являются простота способа позволяет использовать его в амбулаторных условиях, не требует госпитализации больной для оценки чувствительности опухоли к химиотерапии у больной раком молочной железы используют биохимический онкопротеин . Преимущества заявляемого способа отсутствие нежелательных побочных эффектов, которые встречаются при использовании других способов с целью оценки чувствительности опухоли к проводимому лечению способ информативен при применении у больной метастатическим раком молочной железы. Способ иллюстрируется следующими примерами. Пример 1 Больная ЦС., 1956 года рождения, амбулаторная карта 5505/06. Находилась на лечении в РНПЦим. Н.Н. Александрова в 2006 году с диагнозом рак правой молочной железы, субтотальное поражение, метастазы в подмышечных лимфатических узлах справа 430 2 стадия, состояние после комплексного лечения. В 2009 году диагностированы метастазы в левой молочной железе, подмышечных, надключичных лимфатических узлах слева, яичниках. Выполнена двусторонняя овариэктомия. Проведены 2 курса монохимиотерапии по схеме паклитаксел. По данным ультразвукового обследования размеры метастазов в молочной железе и лимфатических узлах незначительно уменьшились. Определена концентрацияв сыворотке крови 280 пг/мл. Проведено еще 2 курса химиотерапии по ранее проводимой схеме. По данным ультразвукового исследования зарегистрировано увеличение размеров подмышечного лимфатического узла слева в 2 ра 5 15575 1 2012.02.28 за (более чем на 25 ) в сравнении с исходными данными. Концентрацияв сыворотке крови после проведенного лечения составила 331,3 пг/мл. Уровеньв крови больной метастатическим раком молочной железы увеличился на 51,3 пг/мл (прогрессирование). Пример 2 Больная .О, 1978 года рождения, амбулаторная карта 802/07. В 2007 году на базе онкомаммологического отделения РНПЦим. Н.Н. Александрова проведено комплексное лечение по поводу рака левой молочной железы 200 2 а стадии. В 2009 году по данным компьютерной томографии диагностированы метастазы в мягких тканях грудной клетки слева с врастанием в грудину, левое легкое, единичные метастазы в легких. Уровеньдо начала лечения по поводу метастатического процесса 443,1 пг/мл. После проведенных двух курсов лечения по схеме паклитакселтрастузумаб концентрацияв сыворотке крови снизилась на 22,7 пг/мл и составила 420,4 пг/мл. По данным компьютерной томографии зарегистрирована выраженная положительная динамика - размеры метастазов в мягких тканях грудной стенки и легких значительно (более чем на 50 ) уменьшились (регрессия). Пример 3 Больная П.С.А., 1956 года рождения, амбулаторная карта 10416/07. В 2007 году проведено комплексное лечение по поводу местно-распространенного нерезектабельного опухолевого процесса правой молочной железы с метастазами в подмышечных, шейных лимфатических узлах справа 210 2 стадия, достигнута ремиссия. Затем в 2009 году рост опухоли в правой молочной железе возобновился. Определена концентрацияв сыворотке крови - 368 пг/мл. Проведено 2 курса полихимиотерапии по схеме паклитекселдоксорубицин. По данным ультразвукового исследования при сравнении с предыдущими данными существенной динамики не отмечено. Концентрацияв процессе лечения практически не изменилась и составила 368,94 пг/мл (стабилизация). Таким образом, с помощью заявленного способа представляется возможным оценить чувствительность опухоли к химиотерапии у больной метастатическим раком молочной железы. Источники информации 1. . - подробно о лекарствах. Справочник лекарств для врачей Электронный ресурс. - 2006. - Режим доступа ////2221202 - Дата доступа 14.12.2009. 2. Маммография - достоинства и недостатки // Европейское качество лечения Электронный ресурс. - 2008. - Режим доступа //// Дата доступа 14.12.2009. 3. Сцинтиграфия - сканирование костной системы // Европейское качество лечения Электронный ресурс. - 2008. - Режим доступа ///// - Дата доступа 14.12.2009. 4. Тюляндин А.С., Носов Д.А., Переводчикова Н.И. Минимальные клинические рекомендации Европейского Общества Медицинской Онкологии . - М. Издательская группа РОНЦ им.Н.Н. Блохина, 2009. - С. 42 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6