Способ определения химиорезистентности опухоли у больной распространенным раком яичников III-IV стадии

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХИМИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ОПУХОЛИ У БОЛЬНОЙ РАСПРОСТРАНЕННЫМ РАКОМ ЯИЧНИКОВ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр онкологии и медицинской радиологии имени Н.Н. Александрова(72) Авторы Мойсей Анна Владимировна Смолякова Раиса Михайловна Крутилина Нина Ивановна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр онкологии и медицинской радиологии имени Н.Н.Александрова(57) Способ определения химиорезистентности опухоли у больной распространенным раком яичника - стадии, при котором после выполнения циторедукции в удаленной опухоли иммуногистохимическим методом по окрашиванию ядра и цитоплазмы клеток и интенсивности их окрашивания определяют уровень экспрессии соответственно белка 53 и белка Вах и при уровне экспрессии белка 53, характеризующемся окрашиванием ядер в 11 или более процентах клеток с сильной интенсивностью окрашивания, и уровне экспрессии белка Вах, характеризующемся окрашиванием цитоплазмы в 25 или менее процентах клеток с умеренной интенсивностью окрашивания, опухоль относят к химиорезистентной,а при уровне экспрессии белка 53, характеризующемся окрашиванием ядер в 10 или менее процентах клеток со слабой интенсивностью окрашивания, и уровне экспрессии белка Вах, характеризующемся окрашиванием цитоплазмы в 25 или более процентах клеток с сильной интенсивностью окрашивания, опухоль относят к химиочувствительной. Изобретение относится к медицине, а именно к онкогинекологии, и предназначено для определения химиорезистентности опухоли у больной распространенным раком яичников до начала адъювантной полихимиотерапии путем иммуногистохимической оценки уровней экспрессии маркеров апоптоза с целью своевременной коррекции специального лечения. Феномен химиорезистентности к различным препаратам объясняется такими механизмами, как уменьшение аккумулирования препарата в клетке, увеличение клеточной детоксификации и увеличение в ДНК восстановительной активности. В развитии химиорезистентности важную роль играют нарушения механизмов апоптоза, пролиферативной активности, ангиогенеза. 15121 1 2011.12.30 При изучении химиорезистентности важную роль отводят механизмам регулирования препарат-индуцированного апоптоза и их влиянию на химиочувствительность. Одним из ключевых механизмов множественной лекарственной устойчивости является ингибирование апоптоза 1-4. Ключевыми белками, которые регулируют состояние апоптоза, являются белки семейства -2,и супрессор опухолевого роста 53. Как известно, ген 53(белок 53) - это транскрипционный фактор, регулирующий клеточный цикл. Ключевую роль в развитии апоптоза играет так называемый дикийтип гена онкосупрессора 53 и кодируемый им белок 53. Он блокирует клеточный цикл в фазе 1- (то есть при переходе из фазы покоя к подготовительному этапу митоза) и тем самым ингибирует дальнейшую репликацию поврежденной ДНК, синтез которой происходит именно в фазе. При этом создаются все условия для репарации поврежденного участка ДНК. В случае удачно завершенной репарации клетка продолжает делиться и давать потомство здоровых клеток. При неудачной попытке устранения повреждений ДНК включаются механизмы,обеспечивающие уничтожение клетки с поврежденной (мутантной) ДНК, то есть запускается программа клеточной гибели или так называемый апоптоз. В норме 53 функционирует как молекулярный полицейский, осуществляющий защиту генома. Дикий тип 53 - короткоживущий тип белка. Его период полураспада не превышает более 20 мин. В немутированном состоянии данный тип белка выполняет функцию супрессора образования злокачественных опухолей. Белок 53 в совокупности с другими белками вызывает апоптоз опухолевых клеток в ответ на химиотерапевтические препараты, которые повреждают их ДНК. Согласно гипотетической модели химиорезистентности рака яичников, в химиочувствительных клетках препараты платины увеличивают содержание 53, что способствует увеличению таких проапоптотических факторов, как ,5. В результате происходит активация как внутреннего (митохондриального), так и внешнего (рецепторсвязанного) путей апоптоза. В процесс также включаются каспазы, медиаторы клеточной выживаемости (, , ) и другие белки. При мутации гена 53 с образованием мутантного типа ( )53 или блокаде 53 определенными протеинами этот ключевой ген апоптоза теряет свою первоначальную функцию, но обретает другие 53 долгоживущий белок, его период полураспада увеличивается до 24 ч, и он успевает накапливаться в количествах, вполне доступных для индентификации. Мутации 53 с образованием 53 и/или функциональная блокада 53 - наиболее частые генетические нарушения, обнаруживаемые в злокачественных опухолях. В химиорезистентных клетках происходит мутация гена 53, снижение регуляции медиаторов клеточной выживаемости, нарушение каскада каспаз и, следовательно, утрата опухолевыми клетками способности отвечать на химиоиндуцированный апоптоз 6. Таким образом, в половине опухолевых клеток обнаруживаются мутации гена 53. Следовательно, ген 53 можно считать протоонкогеном. Российскими коллегами при изучении прогнозирования клинического течения увеальной меланомы (УМ) на основе маркера апоптоза 53 отмечено, что при выявлении более 20 позитивных клеток прогноз для больного считают неблагоприятным в плане сокращения продолжительности жизни и высокой вероятности метастазирования (65 ) 7. Белки семейства -2 выполняют антиапоптотическую роль, в то время какпроапоптотическую. Эти белки регулируют чувствительность опухолевых клеток к различным стимулам апоптоза, в том числе и к цитостатической химиотерапии.-2 - маркер к белку, подавляющему развитие апоптоза. Повышение уровня экспрессии ингибитора апоптоза -2 часто свидетельствует об усилении роста опухолей,нарастании прогрессии и метастазирования, учащении рецидивов, сокращении сроков жизни больных. Рядом авторов при изучении уровня экспрессии данного белка в совокупности с другими маркерами опухоли (-67, 53 и уровня экспрессии маркера меланомы НМВ-45) при определении эффекта лечения неоадъювантной аутогемохимиотерапии в 15121 1 2011.12.30 сочетании с лучевой терапией меланомы кожи установлено, что снижение уровня экспрессии данных маркеров коррелировало с повышением эффективности лечения 8. Согласно мировым данным, имеются публикации об экспрессиив опухолях вообще и при раке яичников в частности, однако литературные данные противоречивы. Одни авторы указывают, что для больных раком молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы экспрессияявляется благоприятным прогностическим признаком, в то же время в первичной и метастатической меланоме кожи, УМ имеет место гиперэкспрессия , связанная с неблагоприятным прогнозом 9. Установлено также, что увеличение экспрессииспособствует увеличению химиочувствительности опухолевых клеток к винка-алкалоидам и паклитакселу 10. В настоящее время при комплексном изучении молекулярно-биологических факторов у больной распространенной формой серозного рака яичников установлено, что отсутствие экспрессииявляется неблагоприятным фактором химиорезистентности опухоли, в то время как другие маркеры апоптоза (53, -2), ангиогенезаи пролиферативной активности (-67) не оказывают влияния на развитие данного феномена 11. Однако приведенный выше способ комплексного изучения молекулярно-биологических маркеров распространенного рака яичников имеет следующие недостатки 1. В анализ включен только серозный вариант опухоли, однако нельзя пренебрегать другими морфологическими вариантами новообразований (эндометриоидный и светлоклеточный морфотипы опухоли), которые встречаются в 50 случаев. 2. Несмотря на десятилетний период наблюдения за больными, авторами не представлены данные о влиянии экспрессии данных маркеров на общую и бессобытийную выживаемость. Больным химиочувствительной группы показано проведение специального лечения по стандартным схемам химиотерапии. Для больных химиорезистентной группы не разработано специальных подходов к выбору тактики лечения. Кроме этого, до настоящего времени не определен спектр молекулярно-биологических маркеров, характеризующий химиорезистентность опухоли яичников, что представляет новизну предлагаемого изобретения. Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа определения химиорезистентности у больных распространенным раком яичников иммуногистохимическим методом с использованием антител к маркерам апоптоза для выбора патогенетически обоснованной адъювантной полихимиотерапии в послеоперационном периоде. Решение поставленной задачи достигают тем, что определение биологических маркеров осуществляют у данной категории больных в удаленной опухоли при первичных или промежуточных циторедуктивных вмешательствах. Проводят совокупную оценку иммуногистохимических маркеров апоптоза 53, , -2, на основании которой больных распространенным раком яичников подразделяют на две группы химиочувствительную и химиорезистентную - для определения тактики ведения больных химиорезистентной группы с использованием резервных схем химиотерапии. Способ осуществляется следующим образом. Описание технологии использования иммуногистохимического метода (ИГХ) определения экспрессии 53 (моноклональные антитела, клон -7, разведение 1300, ,Дания),(поликлональные антитела, разведение 1250, , Дания), -2 (моноклональные антитела, клон 124, разведение 175, , Дания).этап. После выполнения первичной или промежуточной циторедукции готовят парафиновый блок по стандартной технологии, а затем парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм. Их депарафинизируют в ксилоле, регидратируют в батарее спиртов.этап. Для восстановления структуры белка, которая изменилась в ходе фиксации и заливки в парафин, срезы прогревают на водяной бане при 98 С с использованием демаскировочного буфера 9,0 в течение 30 минут. После демаскировки оставляют емкость со срезами при комнатной температуре на 20 минут, обрабатывают дистиллированной водой и 3 перекисью водорода. 3 15121 1 2011.12.30 этап. Инкубацию с первичными антителами проводят при комнатной температуре в течение 30 минут. После первичного антитела стекла промывают -буфером. Затем проводят инкубацию со вторичными антителами. Для визуализации иммуногистохимической реакции используют систему(, Дания). Срезы докрашивают гематоксилином и заключают в бальзам. Оценку результатов окрашивания проводят с применением светового микроскопа (увеличение 10, 20, 40). Оценивают локализацию окрашивания в клетке, интенсивность пероксидазной метки (в области с максимальной экспрессией) и процент окрашенных клеток. В исследовании применяют следующие критерии оценки маркеров исследование 53 опухолевых клеток проводят с помощью антител. Оценивают интенсивность окрашивания в ядрах опухолевых клеток 0 - нет окраски, 1 - слабая, 2 - умеренная, 3 - сильная и процент окрашенных клеток 0 - 0 , 1 - менее 10 , 2 - 11-50 , 3 51-80 , 4 - более 81 . По сумме баллов оценивают уровень экспрессиимаксимальный при 7 баллах, высокий уровень экспрессии при 4-6 баллах, низкий - 2-3 балла исследование , -2 опухолевых клеток проводят с помощью антител. Оценивают локализацию окрашивания в цитоплазме опухолевых клеток 0 - нет окраски, 1 - слабая,2 - умеренная, 3 - сильная и процент окрашенных клеток до 25 окрашиваемых клеток отрицательная окраска, более 25- положительная. Пересмотр гистологических препаратов и оценку иммуногистохимического окрашивания производит один онкоморфолог. Статистическую обработку полученных данных осуществляют с использованием программы 6,0. Для сравнения уровней экспрессии маркеров химиорезистентности в двух изучаемых группах больных (1-я - химиорезистентная группа, прогрессирование заболевания менее или равное 6 месяцам от окончания лечения, 2-я - химиочувствительная, прогрессирование болезни спустя 6 месяцев) применяют непараметрический метод - критерий Манна-Уитни (, 0,05). Экспрессия мутантного 53 у больных химиорезистентной группы варьируется от 32 до 86 и в среднем составляет 50,819,3 . При этом отрицательной экспрессии онкопротеина 53 в данной группе не отмечено. В химиочувствительной группе экспрессия 53 выявлена в одном случае, при этом около 10 опухолевых клеток окрашены положительно с умеренной степенью интенсивности, в остальных случаях опухолевая ткань не окрашена. Уровень экспрессии проапоптотического маркерау больных химиочувствительной группы варьируется от 28 до 78 и в среднем составляет 49,719,9 . У половины больных химиорезистентной группы экспрессияимеет отрицательное окрашивание(до 25 окрашиваемых клеток). Характеристика распределения экспрессии молекулярных маркеров химиорезистентной группы больных представлена в табл. 1. Таблица 1 Характеристика распределения экспрессии молекулярных маркеров у больных химиорезистентной группы Иммуногистохимическая оценка экспрессии белков Интенсивность окрашивания 53, баллы Количество окрашенных клеток 53, баллы Сумма балловПроцент окрашенных клеток 53,Интенсивность окрашивания , баллы Процент окрашенных клеток ,Примечание ДИ - доверительный интервал 4 15121 1 2011.12.30 Распределение окрашиванияпредставлено в табл. 2. Таблица 2 Характеристика распределения экспрессииу больных химиочувствительной группы Иммуногистохимическая оценка Характеристика распределения экспрессии(медиана) Интенсивность окрашивания , баллы 3 (95 ДИ 1,62-3,37) Процент окрашенных клеток ,52 (95 ДИ 28,74-70,59) Получены статистически значимые различия в экспрессии проапоптотического белка(фиг. 1) и мутантного белка 53 (табл. 3) у больных химиочувствительной и химиорезистентной групп. На фиг. 1 приведено распределение проапоптотического антигенав зависимости от химиочувствительности опухоли,0,037. Таблица 3 Значение(критерий Манна-Уитни) при сравнении иммуногистохимической оценки 53 химиочувствительной и химиорезистентной групп больных Иммуногистохимическая оценка экспрессии 53 Значениехимиочувствительной и химиорезистентной группы Интенсивность окрашивания 53, баллы 0,003 Количество окрашенных клеток 53, баллы 0,002 Сумма баллов 0,002 Процент окрашенных клеток 53,0,005 Выживаемость больных распространенным раком яичников химиочувствительной и химиорезистентной групп в зависимости от уровня экспрессии мутантного 53, проапоптотическогопредставлена на фиг. 2-4. В частности, на фиг. 2 показана выживаемость больных распространенным раком яичников химиочувствительной и химиорезистентной групп в зависимости от уровня экспрессии 53. На фиг. 3 - бессобытийная выживаемость больных распространенным раком яичников химиочувствительной и химиорезистентной групп в зависимости от уровня экспрессии 53,0,019 (- тест). На фиг. 4 - бессобытийная выживаемость больных распространенным раком яичников химиочувствительной и химиорезистентной групп в зависимости от уровня экспрессии проапоптотического ,0,034 (- тест). Статистически значимых различий по уровню экспрессиив общей выживаемости больных химиочувствительной и химиорезистентной групп не получено (0,4). У больных химиочувствительной и химиорезистентной групп статистически значимых отличий в уровнях экспрессии -2 не выявлено. Основные отличительные признаки предлагаемого изобретения 1. Согласно способу, больной распространенным раком яичников в удаленной опухоли при первичных или промежуточных циторедуктивных вмешательствах проводят совокупную оценку иммуногистохимических маркеров апоптоза, по данным которой судят о возможном наличии или отсутствии химиорезистентности. 2. Данный способ учитывает наиболее распространенные формы рака яичников, а именно не только серозный, но эндометриоидный и светлоклеточные варианты опухоли. 3. Показано влияние экспрессии мутантного 53 на общую и бессобытийную выживаемость, при этом пятилетняя общая выживаемость химиочувствительной группы составляет 42 , показатели двухлетней общей выживаемости для химиорезистентной и химиочувствительной групп равны 22 и 84 соответственно. 5 15121 1 2011.12.30 4. При гиперэкспрессии (4) мутантного 53 бессобытийная выживаемость у больной распространенным раком яичников с химиорезистентной опухолью статистически значимо ниже (0,019, - тест) по отношению к больной с химиочувствительным типом опухоли. 5. У больной с химиочувствительной опухолью, имеющей положительный статус по(уровень экспрессии 25 ), бессобытийная выживаемость статистически значимо выше (0,034, - тест) по отношению к больной с химиорезистентным типом опухоли. Способ иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Больная Д. Т.Е., 38 лет, а/к 3672/99, ист. болезни 10056/99. Поступила в онкологическое гинекологическое отделение 9.11.1999. При ультразвуковом и клиническом обследовании больной установлен диагноз рак яичников 300,стадия, асцит. Метастазы опухоли в большом сальнике. Диссеминация опухоли по брюшине. Состояние после курса полихимиотерапии 10.1999. 16.11.1999. выполнена неоптимальная промежуточная циторедукция. Гистологическое заключение 81370-77/99 - эндометриоидная (при пересмотре - светлоклеточная) аденокарцинома яичников (3) с метастазами опухоли в большом сальнике. В послеоперационном периоде проведено 6 курсов адъювантной полихимиотерапии. Последний курс проведен 10.04.2000. При оценке эффекта наблюдалась полная регрессия опухоли. При контрольном обследовании 02.02.2001 по данным ультразвукового исследования выявлено прогрессирование заболевания (асцит). Время до возникновения рецидива составило 11 месяцев. Время наблюдения за больной - 39 месяцев. Данных о смерти больной Д. в канцеррегистре не отмечено. В настоящее время проведена иммуногистохимическая обработка послеоперационных микропрепаратов. При иммуногистохимической оценке уровня экспрессии маркеров апоптоза с использованием антител квыявлена гиперэкспрессия данного белка. Положительное окрашивание отмечалось в 60 опухолевых клеток, сильной степени окраски. Наблюдают отсутствие экспрессии при использовании антител к 53, -2. Данный вариант опухоли относится к химиочувствительной. Пример 2. Больная К.С.А., 68 лет, а/к 1959/1999. Поступила в онкологическое гинекологическое отделение 06.04.1999. При ультразвуковом и клиническом обследовании больной установлен диагноз рак яичников 300,стадия, асцит. Метастазы опухоли в большом сальнике. Диссеминация опухоли по брюшине с вовлечением толстой кишки. 06.04.1999. выполнена неоптимальная первичная циторедукция. Гистологическое заключение 36001-07/99 - серозная аденокарцинома яичников (3) с метастазами опухоли в большом сальнике. В послеоперационном периоде проведено комбинированное лечение дистанционная лучевая терапия на область малого таза в суммарной дозе 30 Гр, 6 курсов адъювантной полихимиотерапии. Последний курс проведен 10.01.2000. На фоне проводимого лечения отмечено прогрессирование опухолевого процесса. Дата смерти от новообразования 06.04.2000. Общее время наблюдения за больной составило 12 месяцев. В настоящее время проведена иммуногистохимическая обработка послеоперационных микропрепаратов. При иммуногистохимической оценке уровня экспрессии маркеров апоптоза с использованием антител к 53 выявлена гиперэкспрессия данного белка. Положительное окрашивание отмечалось в 59 опухолевых клеток, сильной степени окраски, при этом 6. Выявлен низкий уровень экспрессии при использовании антител к . Окрашивание отмечено в 21 опухолевых клеток слабой интенсивности. Данный вариант опухоли относится к химиорезистентной. Пример 3. Больная П.З.В., 51 год, а/к 2636/1999. Поступила в онкологическое гинекологическое отделение 01.07.1999. При ультразвуковом и клиническом обследовании больной 6 15121 1 2011.12.30 установлен диагноз рак яичников 300,стадия, асцит. Метастазы опухоли в большом сальнике. Диссеминация опухоли по брюшине. 06.07.1999 выполнена субоптимальная первичная циторедукция. Гистологическое заключение 55597-601/99 - эндометриодная аденокарцинома яичников (3) с метастазами опухоли в большом сальнике. В послеоперационном периоде проведено 8 курсов адъювантной полихимиотерапии. На фоне проводимого лечения отмечено прогрессирование опухолевого процесса. Время наблюдения за больной - 19 месяцев. Данных о смерти больной П. в канцер-регистре не отмечено. В настоящее время проведена иммуногистохимическая обработка послеоперационных микропрепаратов. При иммуногистохимической оценке уровня экспрессии маркеров апоптоза с использованием антител к 53 выявлена гиперэкспрессия данного белка. Отмечено окрашивание 42 опухолевых клеток, сильной степени окраски, при этом 5. Низкий уровень экспрессии отмечен при использовании антител к . Окрашивание отмечено в 10 опухолевых клеток умеренной интенсивности. Данный вариант опухоли относится к химиорезистентной. Пример 4. Больная К.Р.М., 72 года, а/к 3155/01, ист. болезни 8410/01. Поступила в онкологическое гинекологическое отделение 09.08.2001. Больной установлен диагноз рак яичников 311,стадия, асцит. Метастазы опухоли в большом сальнике, печени,паховых лимфоузлах. Диссеминация опухоли по брюшине. Состояние после 3 курсов полихимиотерапии 04-07.2001. Пациентка поступила для хирургического лечения. 28.08.2001 выполнена полная промежуточная циторедукция. Гистологическое заключение 77726-38/01 - серозная аденокарцинома яичников (3) с метастазами опухоли в большом сальнике. В послеоперационном периоде проведено 6 курсов адъювантной полихимиотерапии. Последний курс проведен 01.02.2002. При контрольном обследовании 01.04.2004 клинически выявлено прогрессирование заболевания - метастазы опухоли в паховых лимфоузлах слева. Время до возникновения рецидива составило 26 месяцев. Время наблюдения за больной - 86 месяцев. Данных о смерти больной К. в канцеррегистре не отмечено. В настоящее время проведена иммуногистохимическая обработка послеоперационных микропрепаратов. При иммуногистохимической оценке уровня экспрессии маркеров апоптоза с использованием антител квыявлена гиперэкспрессия данного белка. Положительно окрашены 78 опухолевых клеток, сильной степени окраски. Наблюдают низкий уровень экспрессии при окрашивании с антителами к 53. Окрашены менее 10 опухолевых клеток слабой интенсивности, при этом 2. Отрицательный результат отмечен с использованием антител к -2. Данный вариант опухоли относится к химиочувствительной. Таким образом, использование комплекса молекулярно-биологических маркеров апоптоза позволяет судить о химиочувствительности или химиорезистентности опухоли, а именно гиперэкспрессия 53 (диагностическая эффективность - 91,6 ) и низкий уровень экспрессии(диагностическая эффективность - 66,6 ) характеризуют химиорезистентные опухоли, при этом отсутствие экспрессии 53 (диагностическая эффективность 83,3 ) и гиперэкспрессия(диагностическая эффективность - 100 ) говорят в пользу химиочувствительных опухолей. Изобретение является промышленно применимым, так как может быть использовано в здравоохранении для определения химиорезистентности больных распространенным раком яичников с целью выбора патогенетически обоснованной адъювантной полихимиотерапии в послеоперационном периоде. Данный способ может быть рекомендован для использования в специализированных онкологических учреждениях, патологоанатомических бюро. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8