Способ прогнозирования рецидива рака мочевого пузыря после радикального лечения

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РЕЦИДИВА РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ПОСЛЕ РАДИКАЛЬНОГО ЛЕЧЕНИЯ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр онкологии и медицинской радиологии имени Н.Н.Александрова(72) Авторы Шишло Людмила Михайловна Прохорова Виолетта Игоревна Державец Лилия Александровна Пашкова Оксана Леонидовна Акалович Светлана Тадеушевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр онкологии и медицинской радиологии имени Н.Н.Александрова(57) Способ прогнозирования рецидива рака мочевого пузыря после радикального лечения,включающий иммуноферментное определение в моче прогностического показателя, отличающийся тем, что в качестве прогностического показателя определяют растворимый рецептор р 55 фактора некроза опухоли, при этом рецидив рака мочевого пузыря прогнозируют, если концентрация р 55 превышает 4,6 нг/мл. Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, в частности к способам лабораторного прогнозирования рецидива рака мочевого пузыря. Трансуретральная резекция (ТУР) является радикальным лечением у больных с поверхностными опухолями мочевого пузыря стадии Та-Т 1, однако после операции в 6080 случаев наблюдаются рецидивы. К причинам рецидива относятся очаги рака, а также мелкие папиллярные очаги при мультифокальном росте, пропущенные при первой ТУР, имплантация клеток при оперативном вмешательстве и неустраненные этиологические факторы 1. Согласно современным представлениям, прогноз у больных раком мочевого пузыря(РМП) обусловлен многими показателями. Так, прогностически неблагоприятными признаками, связанными с высоким риском рецидивирования, являются большие размеры опухоли, инфильтрирующий характер роста опухоли, увеличение стадии заболевания и снижение степени дифференцировки опухолевых клеток, а также некоторые другие клинические и морфологические данные 2. Послеоперационное наблюдение за больными с новообразованиями мочевого пузыря направлено на предотвращение рецидивирования и прогрессирования заболевания. Золо 14301 1 2011.04.30 тым стандартом обнаружения рецидива РМП является контрольная цистоскопия с биопсией. Для выявления рецидива выполняют послеоперационное наблюдение за больным контрольная цистоскопия через каждые 3 месяца в первый год, 1 раз в 6 месяцев в последующий год, и затем 1 раз в год пожизненно (в том числе с флюорохромами и гистопатологическим исследованием) 3. Такой контроль позволяет надежно обнаружить рецидивные опухоли. Однако фиброцистоскопия, наряду с преимуществами, имеет и ряд недостатков, среди которых на первом месте стоит неудобство для больного, большая вероятность инфекционных осложнений, высокая стоимость, необходимость в высококвалифицированном персонале. В настоящее время проводится активный поиск дополнительных прогностических критериев, которые бы могли позволить при контрольных осмотрах отказаться от цистоскопии в пользу менее инвазивных лабораторных исследований мочи и крови. Это стало возможным благодаря созданию и внедрению в клиническую практику новых методовдиагностики злокачественных новообразований с использованием высокоспецифичных моноклональных антител 4-5. На любую опухоль организм реагирует, как на чужеродную ткань, пытаясь ее элиминировать. Активация иммунной системы приводит к выбросу провоспалительных цитокинов, в частности фактора некроза опухоли- (ФНО-). Хотя ФНО- относится к факторам иммунной системы, в современной онкологии он считается проканцерогенным агентом. Большое количество исследований показывает, что ФНО- - связующее звено между воспалением и раком 6. В организме онкологического больного он экспрессируется, главным образом, активизированными макрофагами, но имеются данные о его выделении клетками опухоли 7. Определение самого ФНО- в крови, секретах или тканях не имеет существенной диагностической ценности, так как выделяющийся фактор быстро сорбируется на клетках и тканях. Вместе с тем участие ФНО- в патологии легко определяют благодаря тому, что связывание его со специфическими рецепторными белками, в основном рецептором р 55, приводит к их отщеплению с поверхности и переходу в растворимую форму. Растворимые рецепторы ФНО циркулируют в крови не менее суток и являются стабильным маркером системных и локальных реакций, опосредованных ФНО. Высокий уровень растворимого рецептора ФНО р 55 в крови наблюдается при различных нозологических формах рака и способствует метастазированию, опухолевому ангиогенезу и кахексии 8-12. Известен способ прогнозирования рецидива у больных меланомой кожи. Сущность изобретения состоит в том, что у женщин репродуктивного возраста определяют суточную экскрецию с мочой эстрона, эстрадиола и эстриола, рассчитывают величину соотношения экскреции эстриола к суммарной величине экскреции эстрадиола и эстрона после лечения и на этапе контрольного наблюдения и при увеличении указанного соотношения прогнозируют рецидив 13. Данный способ имеет следующие недостатки 1. Указанный способ прогнозирования рецидива заболевания не может использоваться при раке мочевого пузыря, поскольку был разработан для конкретной нозологической формы - меланомы кожи. 2. Способ является достаточно трудоемким для выполнения, так как требует определения нескольких параметров с последующим расчетом величин соотношений их экскреции. 3. Способ обременителен для пациента, так как подразумевает сбор суточного количества мочи. Также известен способ прогнозирования рецидива серозного рака яичников. Вероятность развития рецидива представляется дихотомической переменной, вычисляемой по формуле, определяемой логистической регрессией, включающей комбинацию нескольких переменных, которыми являются морфологические параметры опухоли, а именно площадь опухолевой клетки, средняя плоидность ядер опухолевых клеток, уровень экспрес 2 14301 1 2011.04.30 сии р 53, уровень экспрессии рецепторов эстрогена, уровень экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток 14. Недостатками способа являются 1. Способ может использоваться только для прогнозирования рецидива рака яичников. 2. Способ является весьма трудоемким и материально затратным в связи с определением, по крайней мере, двух морфологических и трех лабораторных показателей. 3. Способ требует дополнительного программного обеспечения для расчета дихотомической переменной. Известен способ прогнозирования рецидивов в мочевой пузырь у больных раком почечной лоханки и мочеточника после радикального хирургического лечения. Сущность изобретения состоит в том, что оценивают индексы пролиферации -67 раковых клеток биоптата не менее чем в пятнадцати полях зрения, определяют их минимальное, максимальное и среднее значения, рассчитывают показатель 0,06 - 670,18- 67 - 0,111 - 67, и при значениях Р 3,75 прогнозируют отсутствие рецидивов 15. Недостатками способа являются 1. Инвазивность метода - необходимо производить биопсию новообразования. 2. Невозможность применения способа для пациентов с первичным раком мочевого пузыря, так как он разработан для прогнозирования рецидивов в мочевой пузырь у больных раком почечной лоханки и мочеточника. 3. Невозможность диагностики в режиме реального времени и на живых тканях биопсию проводят однократно, во время радикального хирургического лечения. Наиболее близким к предлагаемому изобретению и принятым за прототип является способ диагностики рака мочевого пузыря, предполагающий определение иммуноферментным методом уровней интерлейкина-8, фактора некроза опухоли- и активности арилсульфатазы-А в моче и сыворотке крови больных раком мочевого пузыря в качестве диагностического и прогностического набора тестов 16. Недостатком предложенного способа является определение самого ФНО-, который не имеет существенной диагностической ценности, так как выделяющийся фактор быстро сорбируется на клетках и тканях. Определение нескольких параметров является трудоемким, а забор крови из вены инвазивной процедурой для пациента. Задача разработать неинвазивный способ прогнозирования рецидива рака мочевого пузыря, доступный в методическом выполнении и обладающий свойством раннего реагирования на начальные проявления активации опухолевого процесса. Поставленная задача достигается тем, что у пациента, прошедшего радикальное лечение по поводу рака мочевого пузыря, при контрольном осмотре в порции мочи иммуноферментным методом определяют концентрацию растворимого рецептора ФНО р 55. В случае если у обследуемого больного данный показатель превышает пороговый уровень 4,6 нг/мл, прогнозируют рецидив рака мочевого пузыря. Предложенный способ осуществляется следующим образом у пациента, прошедшего радикальное лечение по поводу РМП, при контрольных осмотрах до начала всех видов обследования берут произвольно выпущенный образец мочи, центрифугируют при 1500 об/мин 10 минут, декантируют. Исследование мочи производят сразу либо замораживают образец при температуре -20 С на длительное время. Размороженные образцы стабильны и годны в течение 8 часов при температуре 2-8 С. Следует избегать повторной заморозки-оттаивания. Принцип способа основан на сэндвич-варианте твердофазного количественного иммуноферментного определения концентрации растворимого рецептора ФНО р 55 на плашечном иммуноферментном анализаторе. Для реализации этого варианта используют два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к р 55. Одно из них иммобилизируют на твердой фазе - внутренняя поверхность лунок плашки, куда вносят образцы, стандарты, контроли и инкубируют 1 час. Второе моноклональное антитело, а затем и конъюгат стрептавидин-пероксидазы хрена в фосфатно 3 14301 1 2011.04.30 солевом буфере вносят и инкубируют аналогично предыдущему шагу. После каждого этапа инкубации проводят трехкратную отмывку буфером. Ферментативную активность пероксидазы измеряют в присутствии тетраметилбензидина (ТМБ) после добавления 1 Н серной кислоты при длине волны для фильтра 450 нм. После построения калибровочной кривой определяют концентрацию р 55 в анализируемом образце по измеренной оптической плотности. Возможно применение любых коммерческих иммуноферментных тестсистем, позволяющих определять р 55 в биологических жидкостях, согласно инструкции фирмы-производителя. Результат исследования сравнивают с пороговым уровнем, который рассчитывают с помощью пакета программ 6.0 17 либо другим доступным способом (,калькулятор). При превышении данного уровня у пациента прогнозируют рецидив РМП и направляют на дополнительное инструментальное обследование для подтверждения прогноза и уточнения степени инвазии. За пороговый уровень концентрации рецептора р 55 при прогнозе рецидивирования РМП принята величина 2 (где- среднее арифметическое значение концентрации р 55,- стандартное отклонение), рассчитанная для группы контроля (20 клинически здоровых лиц и 10 пациентов с неонкологическими заболеваниями мочевого пузыря - цистит,доброкачественная гиперплазия предстательной железы), что составило 4,6 нг/мл 18. Среднее арифметическое значение рассчитывают по формуле,где- - значение концентрации растворимого рецептора р 55- количество значений. Стандартное отклонение рассчитывают по формуле, 1 где- - значение концентрации растворимого рецептора р 55- среднее арифметическое значение концентрации растворимого рецептора р 55- количество значений. Подтверждением эффективности предлагаемого способа прогнозирования рецидива РМП являются результаты наблюдения за 30 лицами группы контроля (20 клинически здоровых лиц и 10 пациентов с неонкологическими заболеваниями мочевого пузыря - цистит, доброкачественная гиперплазия предстательной железы), 20 онкологическими больными с впервые установленным диагнозом РМП, 10 из которых наблюдаются через 3-5 месяцев после радикальной ТУР и не имеют рецидивов, и еще 23 пациентами с возвратом заболевания (рецидив). Концентрация р 55 в моче больных РМП при возврате заболевания и первичных больных до проведения лечения сходная и достоверно выше, чем в группах контроля и пациентов без рецидивов (после радикального хирургического лечения) (0,05). Преимущества предлагаемого способа 1. Обладает простотой в методическом выполнении. 2. Является неинвазивным и может использоваться многократно даже в амбулаторных условиях. 3. Обеспечивает выявление активации опухолевого процесса до его клинического проявления, что позволяет планировать наиболее эффективный путь лечения для больного. Основные отличительные признаки предлагаемого изобретения 1. Способ заключается в иммуноферментном определении концентрации растворимого рецептора ФНО р 55 в моче, который в отличие от самого ФНО циркулирует в крови достаточно длительное время и обладает ценным свойством реагирования на начальные этапы активации опухолевого процесса. 4 14301 1 2011.04.30 2. Интерпретация результатов является удобной и нетрудоемкой. 3. Способ необременителен и безопасен для пациента. Способ иллюстрируется следующими примерами. Пример 1 Пациентка Б.Н.Е., 57 лет, а/к 4208/07, ист. болезни 10923/07. В апреле 2007 года в Барановичском онкодиспансере ей была выполнена ТУР мочевого пузыря по поводу поверхностного переходноклеточного РМПстадии. Поступила в онкоурологическое отделение РНПЦ ОМР им. Н.Н.Александрова 13.08.2007 г. с подозрением на рецидив рака мочевого пузыря. Сопутствующие заболевания - артериальная гипертензия (степень 2, риск 3), ИБС. 14.08.2007 г. проведено определение рецептора р 55 в моче, который составил 5 нг/мл, что выше порогового уровня. Прогнозируем рецидив РМП. 15.08.2007 г. пациентке проводят цистоскопию мочевого пузыря с биопсией. На правой боковой стенке визуализируются 2 опухоли. Основная опухоль - папиллярная на широком основании, 0,5 см в диаметре. Гистологическое заключение 47628-32 переходноклеточный рак, 11. Пример 2 Пациент Б.К.И., 68 лет, а/к 1234/03, ист. болезни 15293/07. В 2003 году в РНПЦ ОМР им. Н.Н.Александрова у него диагностирован поверхностный переходноклеточный РМП, по поводу чего была выполнена ТУР мочевого пузыря. 06.11.2007 г. поступил в онкоурологическое отделение РНПЦ ОМР им.Н.Н. Александрова. Подозрение на рецидив. Сопутствующие заболевания - ИБС, стенокардия напряжения (функциональный класс 2), гипертоническая болезнь (степень 3, риск 4), хронический простой бронхит в стадии ремиссии ДН . 08.11.2007 г. проведено определение рецептора р 55 в моче, содержание которого составило 8,2 нг/мл, что выше порогового уровня. Прогнозируем рецидив РМП. 09.11.2007 г. пациенту проводят ТУР мочевого пузыря. Опухоль единичная, папиллярная на широком основании, 0,4 см в диаметре. Гистологическое заключение 3175564 - переходноклеточный рак, 11. Пример 3 Пациент К.Б.И., 56 лет, а/к 7397/07, ист. болезни 17194/07. В 2006 году лечился по поводу инвазивного РМПстадии, выполнена радикальная ТУР мочевого пузыря. 10.12.2007 г. поступил в онкоурологическое отделение РНПЦ ОМР им. Н.Н.Александрова для контрольного обследования. Сопутствующие заболевания - хронический простой бронхит в стадии ремиссии ДН ,ИБС. 11.12.2007 г. проведено определение рецептора р 55 в моче, содержание которого составило 18 нг/мл, что выше порогового уровня. Прогнозируем рецидив РМП. 21.12.2007 г. пациенту проводят операцию Бриккера. Гистологическое заключение 174539-52 - переходноклеточный рак с врастанием в простату, 41. Пример 4 Пациент Е.В.Ф., 77 лет, а/к 1445/08, ист. болезни 3463/08. В марте 2008 года проведено радикальное лечение РМПстадии. До проведения ТУР мочевого пузыря уровень р 55 в моче составил 6,7 нг/мл. 09.07.2008 г. поступил в онкоурологическое отделение РНПЦ ОМР им. Н.Н.Александрова для контрольного обследования. Сопутствующие заболевания - ИБС, симптоматическая артериальная гипертония. 10.07.2008 г. проведено определение рецептора р 55 в моче, содержание которого составило 2,9 нг/мл, что ниже порогового уровня. Рецидив РМП отрицаем. 10.07.2008 г. пациенту проводят контрольную цистоскопию мочевого пузыря. Данных за рецидив не выявлено. Ремиссия. Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает раннее выявление активации опухолевого процесса, что позволяет планировать наиболее эффективный путь лечения для больного. Это качество в сочетании с относительной простотой определения данного по 5 14301 1 2011.04.30 казателя и безопасностью для здоровья пациента (неинвазивность) позволяет предложить его в качестве оценочного теста для выявления больных, подлежащих более углубленному обследованию на предмет выявления рецидива РМП. Источники информации 1. Онкология / Под ред. проф. И.В.Залуцкого. - Минск Вышэйшая школа, 2007. - С. 582. 2. Аль-Шукри С.Х., Корнеев И.А. Общие принципы лечения больных раком мочевого пузыря. Значение клинических, гистологических и биологических факторов прогноза для выбора метода лечения // Практическая онкология. - 2003. - Т. 4,4. - С. 204-213. 3. Алгоритмы диагностики и лечения больных злокачественными новообразованиями / Под ред. член-корр. НАН Беларуси, д.м.н., проф. И.В.Залуцкого, д.м.н., проф Э.А.Жаврида. - Минск, 2007. - С. 422. 4.,22 (22) ,( )/ .. //. - 1999. - . 23,3. - . 215-225. 7.-(-)/ . //. - 1999. - . 19, 6. - . 5657-5662. 8..,.//. - 2004. . 2,- . 131-148. 9.-/ .. //. - 2007. - . 26, 6. - . 728-735. 10.,-/ .. //. - 2008. - . 59,2. - . 240-245. 11.-2/ .. //. - 2000. - . 6,4. - . 661-667. 12.-// .. //. - 2007. . 67,2. - . 585-592. 13. Патент РФ 2275637. Способ прогнозирования рецидива у больных меланомой кожи, 2004, МПК 01 33/74. 14. Патент РФ 2290078. Способ прогнозирования рецидива серозного рака яичников,2005, МПК 01 33/48. 15. Патент РФ 2275636. Способ прогнозирования рецидивов в мочевой пузырь у больных раком почечной лоханки и мочеточника после радикального хирургического лечения,2004, МПК 01 33/53. 16.-8,--/ .. //. - 2004. - . 37,8. - . 673-678 (прототип). 17. Халафян 6. Статистический анализ данных. - . ООО БиномПресс, 2008. - С. 81-82. 18. Гланц С. Медико-биологическая статистика Пер. с англ. - М. Практика, 1998. - С. 37. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.