Способ диагностики аллергии

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Авторы Новиков Павел Дмитриевич Новикова Надежда Дмитриевна Новиков Дмитрий Кузьмич(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(57) Способ диагностики аллергии, отличающийся тем, что лейкоциты, полученные из венозной крови, инкубируют с аллергеном, центрифугируют, к отделенной надосадочной жидкости добавляют субстрат-хромогенную смесь, содержащую ортофенилендиамин или тетраметилбензидин и перекись водорода, инкубируют 15-20 мин, останавливают реакцию путем внесения раствора серной кислоты, при 450 нм на фотометре определяют оптические плотности опытной и контрольной проб и при получении значения оптической плотности опытной пробы, не менее чем в 2 раза превышающего значение оптической плотности контрольной пробы, диагностируют аллергию. Изобретение относится к медицине, в частности к аллергологии, и может быть использовано для диагностики аллергии. Известно, что в острый период аллергических заболеваний, таких как бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит и др. в очаге воспаления наряду с эозинофилами, тучными клетками и Т-лимфоцитами присутствуют нейтрофилы 1, 5. После контакта с аллергеном эти клетки активируются и секретируют специфические для них белки эозинофильный катионный белок, эозинофильную пероксидазу, миелопероксидазу и триптазу. Данные белки выявляются в разных биологических жидкостях (сыворотка крови, мокрота, лаважная жидкость). Миелопероксидаза является специфическим и доступным для клинического исследования маркером гранулоцитов 2, 3. Наибольшее ее содержание обнаружено в азурофильных секреторных гранулах нейтрофилов. По данным литературы, встраивание секреторных гранул в плазматическую мембрану гранулоцитов с последующей секрецией миелопероксидазы может запускаться хемоаттрактантами (например, -формил-метионил-лейцил-фенилаланином) или же через -рецепторы, причем активность фермента миелопероксидазы повышается до секреции ее из гранул 6, 7. На поверхности всех лейкоцитов имеются -рецепторы,9481 1 2007.06.30 которые связывают -фрагменты иммуноглобулинов различных классов, в том числе обладающие специфичностью антител. Поэтому, с одной стороны, лейкоциты с помощью этих антител могут специфично взаимодействовать с антигенами-аллергенами, с другой концентрация антител в крови снижается и нередко из-за этого они не выявляются в сыворотке крови. Базофилы имеют - рецепторы, связывающие , а нейтрофилы несут, фиксирующие , три типа рецепторов , различающиеся по аффиности, связывающие 1, 4. Прототипом патента служит способ выявления аллергии в реакции повреждения гранулоцитов (РПГ) 1, 2. Этот метод включает следующие этапы выделение лейкоцитарной фракции крови инкубацию выделенных клеток с аллергенами подсчет количества поврежденных клеток после окраски раствором трипанового синего визуальный подсчет количества поврежденных нейтрофилов под микроскопом. Основной недостаток выбранного прототипа - необходимость трудоемкого процесса визуального подсчета поврежденных клеток, используя микроскоп, что практически исключает его применение для скрининговых исследований. Метод РПГ взят нами за прототип. Предлагаемый нами способ позволяет отказаться от использования трудоемкого процесса окраски и подсчета клеток и дает возможность применять скрининговые исследования и выявление аллергии к большому спектру аллергенов у различных больных. Сущность изобретения заключается в том, что после инкубации лейкоцитов (гранулоцитов) с аллергенами их смесь центрифугируют, отсасывают надосадочную жидкость и добавляют к ней субстрат-хромогенный раствор (ортофенилендиамина - ОФД или тетраметилбензидина - ТНБ и перекиси водорода) и по увеличению интенсивности окраски,оцениваемой визуально или на фотометре, судят о приросте активности миелопероксидазы, что позволяет определить наличие или отсутствие сенсибилизации гранулоцитов - аллергии. Выполнение способа включает следующие этапы диагностики аллергии выделение лейкоцитарной (гранулоцитарной) фракции крови добавление к ним аллергенов инкубация выделенных гранулоцитов с аллергенами при 37 С в течение 45 мин центрифугирование смеси отсасывание надосадочной жидкости добавление к надосадочной жидкости субстрат-хромогенного раствора оценка реакции визуально или на фотометре при длине волны 450 нм. Предложенный способ диагностики аллергии в реакции выброса миелопероксидазы гранулоцитами под влиянием аллергенов осуществляется следующим образом. А. Подготовка клеток больного для постановки реакции выброса миелопероксидазы 1. Получение лейкосуспензии. Кровь берут из вены в пробирку с гепарином (20 ед. на 1 мл крови). В зависимости от количества проб с аллергеном достаточно от 3 до 10 мл крови. Кровь отстаивают в узких пробирках до момента четкого отделения эритроцитов от плазмы. Плазму с лейкоцитами отсасывают, центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин. Плазму отсасывают. К осадку лейкоцитов добавляют 8-10 мл раствора лизирующего эритроциты (0,84 теплый - 37 С раствор хлористого аммония). Ресуспензируют и снова центрифугируют. Затем, полученную лейкосуспензию отмыть не менее трех раз стерильным физиологическим раствором, приготовленном на фосфатном буфере рН 7,2. 2 9481 1 2007.06.30 2. Разведение суспензии. Разведение клеток в лейкосуспензии должно быть при содержании 6-9 тыс.109 кл/л - 1/3 от объема крови например, из 10 мл крови выделяют суспензию и доводят объем до 3,3 мл физиологическим раствором. При более низком содержании лейкоцитов разведение лейкосуспензии должно составлять 1/4-1/5 от объема крови, при высоком содержании - более 12 тыс.109 - 1/2,5-1/2 от объема крови. Б. Подготовка аллергенов. В реакции используются стандартные аллергены для постановки кожных проб производства предприятия Аллерген г. Москва и ПО Аллерген г. Ставрополь. Все аллергены перед постановкой теста разводится 1100 стерильным физиологическим раствором. При постановке реакции с лекарствами препараты разводятся стерильным физиологическим раствором 11000 средней терапевтической дозына кг массы тела. Ход реакции. В круглодонные лунки иммунологических планшет или микропробирки вносят 0,1 мл лейкосуспензии и добавляют к ней 0,1 мл (100 мкл) раствора аллергена. Пробы дублируют. Параллельно ставятся контрольные пробы к лейкосуспензии каждого больного добавляют аналогично физиологический раствор (отрицательный контроль). Смеси инкубируют 45 мин при 37 С. Центрифугируют (если реакция ставится в планшетах, то на планшеточной центрифуге) в течение 10 мин при 1500 об/мин или 5 мин при 2000 об/мин. Отсасывают надосадочную жидкость из микропробирок и/или круглодонной планшеты. Из каждой лунки круглодонной планшеты и/или микропробирки осторожно (чтобы не взболтать клетки) забирают 50 мкл надосадочной жидкости и переносят в лунку (под тем же номером) плоскодонной планшеты и/или в другую микропробирку. Вносят проявляющий раствор во все лунки планшеты и/или микропробирки к надосадочной жидкости добавляют по 150 мкл хромоген-субстратной смеси (0,015Н 2 О 2 и ТМБ или ОФД, разведенные фосфат-цитратным буфером с рН 5,0). Проявляющий раствор готовится непосредственно перед внесением. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15-25 мин до появления выраженного окрашивания синего цвета. Останавливают реакцию внесением 50 мкл 4 серной кислоты - цвет раствора изменяется на желтый. Учет результатов. Оценку реакции проводят визуально, либо на фотометре при длине волны 450 нм. Примечание в отрицательной контрольной пробе - раствор не должен быть окрашен, либо слабо окрашен (при замере на фотометре оптическая плотность в отрицательной лунке не должна превышать 0,300). Положительной реакция считается А. При визуальной оценке результатов - окраска опытной пробы более желтая, чем пробы отрицательного контроля и легко различима В других случаях реакция трактуется как сомнительная. Б. При фотометрической оценке результатов оптическая плотность опытной пробы превышает оптическую плотность пробы отрицательного контроля не менее чем вдвое и она не менее 0,600. При превышении оптической плотности опытной пробы по сравнению с пробой отрицательного контроля менее чем в 2 раза, а также в других случаях результат считается сомнительным. Возможные ошибки проведения реакции А. Интенсивное окрашивание в лунке отрицательного контроля 1. Взбалтывание при переносе надосадочной жидкости. 2. Несвоевременная остановка реакции. 3 9481 1 2007.06.30 3. Очень густая лейкосуспензия (в этом случае все лунки опытных проб будут окрашены, но неодинаково). 4. Возможна нестабильность клеточных мембран лейкосуспензии больного (в этом случае все лунки опытных проб будут одинаково окрашены). Б. Другие 1. Неправильно приготовлен или неактивен проявляющий раствор. 2. Сильно разведена лейкосуспензия. Клиническая апробация способа. Нами обследовано 218 больных бронхиальной астмой, атопическим дерматитом, аллергическим ринитом с достоверной сенсибилизацией к бытовым (домашняя пыль, перо подушки), пыльцевым (береза, овсянница), пищевым (молоко, яйцо) и лекарственным(пенициллин) аллергенам. Для постановки этиологического диагноза изучали анамнез заболевания, проводили специфическое аллергологическое обследование, которое включало кожные пробы (скарификационные, внутрикожные, р-тест), провокационные тесты (назальные, ингаляционные). Сенсибилизацию считали достоверно установленной при совпадении данных анамнеза с результатами специфического аллергологического обследования. Больные были разделены на четыре группы по данным анамнеза и специфического аллергологического обследования. 1-ю группу составили 54 больных с сенсибилизацией к бытовым аллергенам домашней пыли и перу подушки. Во 2-ю группу вошли 64 больных с сенсибилизацией к пыльцевым аллергенам. В 3-ю группу включили 67 больного с пищевой аллергией. К 4-й группе отнесли 33 больных с сенсибилизацией к пенициллину с лейкоцитами всем больным ставили реакцию выброса миелопероксидазы (РВМ) под влиянием аллергенов домашней пыли, пера подушки, березы, овсянницы, молока, яйца и реакция повреждения гранулоцитов(РПГ) (прототип). Результаты клинической апробации РВМ в сравнении с РПГ приведены в табл. 1. Таблица 1 Количество положительных реакций, выявляемых в РВМу больных 1 -4-й групп с достоверно выявленной сенсибилизацией РВМ РПГ положительные результаты в 1-я(54) 78,2 72,4 2-я (64) 77,3 74,3 3-я (67) 88,1 78,1 4-я (33) 82,7 76,6 Всего (218) 81,4 75,6 Как видно из табл. 1, РВМ не уступает общепринятому методу диагностики аллергии, а даже превосходит РПГ. Наиболее высока достоверность при пищевой сенсибилизации 88,1 . Вероятно, это связано с тем, что при пищевой аллергии большую роль играют -независимые механизмы аллергии, опосредованные -антителами 5. Для оценки специфичности РВМ была применена предварительная элиминация специфических антител с гранулоцитов в кислой среде с дальнейшим определением их в элеате методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты корреляционного анализа между РВМ и наличием -специфических антител в элюате приведены в табл. 2. Из представленных результатов видно, что у всех групп больных выявлена сильная прямая корреляция РВМ и содержания -специфических антител в элюате, что подтверждает специфичность реакции выброса миелопероксидазы. Группы больных 9481 1 2007.06.30 Таблица 2 Корреляционная связь результатов РВМ с содержанием -специфических антител, выявленных методом ИФА в группах исследуемых больных с достоверно выявленной сенсибилизацией ИФА РВМ Коэффициент корреляции/уровень значимости 1-я(54) 0,81320,05 2-я (64) 0,79110,05 3-я (67) 0,89140,01 4-я (33) 0,70890,05 Достоинствами способа диагностики аллергиив реакции выброса миелопероксидазы гранулоцитами являются следующие 1) высокая чувствительность, специфичность и достоверность диагностики аллергии 2) простота метода, экономия трудозатрат и времени проведения реакции, возможность скрининговых исследований 3) постановка тестов с аллергенами и лекарственными препаратами не производящимися или коммерчески недоступными в настоящее время 4) выявление антител, связанных клетками, что дает более точную диагностику в острый период заболевания и/или период контакта с аллергеном 5) возможность применения метода в обычно оснащенных лабораториях лечебнопрофилактических учреждений, включая районное звено. Как видно из результатов лабораторной и клинической апробации способа, диагностика аллергиив реакции выброса миелопероксидазы гранулоцитами, обеспечивает достижение технического результата и обладает хорошей диагностической эффективностью. Практическое применение предлагаемого способа в медицине позволит повысить точность диагностики аллергии у человека при различных аллергических заболеваниях. Источники информации 1. Новиков Д.К, Сергеев Ю.В, Новиков П.Д. Лекарственная аллергия. - М. Национальная академия микологии, 2001. - 330 с. 2. Новиков Д.К., Новикова В.И. Оценка иммунного статуса. - М., 1996. - 326 с. 3.,К.,.,.,С.С.,., ,-// . - 1998. -11. - . 43664374. 4.С,.,-// . . - 1995.8-. 1079-1084. 5..,А.С.// .. - 1996. -1 - . 1-14. 6..,.-// . . 1997. -1. - . 409-418. 7..,.С.С..,.//. . . - 1997. -1. - . 209-212. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5