Способ диагностики пищевой аллергии у детей

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПИЩЕВОЙ АЛЛЕРГИИ У ДЕТЕЙСпособ диагностики пищевой аллергии у детей путем определения содержания ажшергенспецифических 15 Етантител в биологических жидкостях, отличающийся тем, что аллергенспецифические дБ-антитела определяют в слюне и при их содержании выше 0,209 единиц(71) Заявитель Белорусский государственный институт усовершенствования(73) Патентообладатели Белорусский государственный институт усовершенствования врачей (ВЧ)Сукова ОПТИЧССКОЙ ПЛОТНОСТИ ДИЗГНОСТИРУЮТ ПИЩЕВУЮ аллергию.Изобретение относится к медицине, а иъаевно к области клинической иммунологии и аллер 10110171114.Задачей способа является повышение чувствительности способа диагностики пищевой аллергии у детей.Известен способ диагностики пищевой аллергии путем выявления аллергенспецифических ЩЕ-антител в сыворотке крови. Однако диагностическая ценность данного способа невысока. Это связано с автономностью локального синтеза иммуноглобулинов класса Е в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта в ответ на антигенное раздражение. Слюна осуществляет барьерную функцию в отношении антигенов пищевого происхождения, а местные иммуноглобулины Е играют ведущую роль в патогенезе пищевой аллергии.Способ осуществляют следующим образом.Ротоглототшый секрет (слюну) собирают утром в 7-8 часов натощак в пластмассовые пробирки, центрифугирухот в течение 20 минут со скоростью 7000 об/вшн. Супернатант отсасывают, замораживают ихранят при темпергъ туре - 20 С до момента исследования.Уровень специфических 15 Е-антптел определяют методом иммуноферментною анализа с использованием тест-систем отечественного производства (гдтаврополь, НПО Аллерген). Тест-система иммуноферментная представляет собой комплект, состоящий из следующих реагентовРеагент 8 (Р 8) - полистироловые стрипы с адсорбированными пищевыми аллергенами 10 видов.Перед постановкой реакции готовят следующие рабочие растворыРаствор Ы 1 - разводящий и промывающий раствор Рб развести в 2 л 0,85 И, раствора хлорида натрия, рН 7,3 1 0,1. Коррекцию рН проводить 0,2 М раствором натрия фосфорнокислого двузамешенногоРаствор Ы 2 - рабочий раствор конъюгата 0,2 мл РЗ довести до объема 20 мл раствором Ы 1 (на 1 планшет)Раствор Ы 3 - раствор нитратного буферного раствора 1,2 мл Р 4 довести до объема 20 мл дистиллированной водой, рН 4,7 1 0,2 (на 1 планшет)Раствор Ы 4 - раствор индикатора 1 таблетку Р 5 растворить в 20 мл раствора Ы 3 (на 1 плаъппет). Растворы Ы 3 и Ы 4 готовить непосредственно перед употреблением2. Исследуемые секреты больных распреДСЛЯЮТ ДЛЯ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ЗНЕЛИЗЗ.3. Освобождают наборный планшет из волиэтиленового пакета.В каждую лунку 1 ряда (по вертвкшш) вносят по 0,2 мл раствора Ы 1. Во все лунки последующих рядов сгрипов вносят по 0,1 мл раствора Ы 1.ВлункиАиВ 2-хорядавносятпо 01 мл рЗСШОрЗАВДГУШШСИД-ПООДЪЯЛРЗСШОРЗВ,влушщЕиН-поод млрастворацвлуъпш С и Н - по 0,1 мл раствора Д. Все растворы реагента Р 2 являются положительными контрольными пробами тест-системы. Во все лунки последующих рядов вносят по 0,1 мл исследуемых секретов в дубликатах. Отрицательную сыворотку (реагент 7), не содержащую 13 Е-антител, добавляют в количестве 0,1 мл в любую из свободных лунок стрипа любой специфичности. Наборный планшет закрывают крышкой и помещают в термостат при Т 37 1 1 град. на 1 час для образования комплекса антиген-антитело.4. По истечении времени инкубации жидкость из лунок удаляют и каждую лунку заполняют доверху раствором Ы 1 на 2-3 МИНУТЫ, ПОСЛЕ ЧЕЛ ЖИДКОСТЬ ВНОВЬ удаляют. Процедуру повторяют не менее 3-х раз. По окончании отмывки планшет осушают на фильтровальной бумаге.5. Инкубация с конъюгатом. В каждую лунку наборного планшета вносят по 0,2 мл рабочего раствора Ы 2. Планшеты закрывают крышкой и помещают в термостат на 1 час при Т 37 1 град.б. Отмывку планшета производят как описано в пункте 4, повторить процедуру не менее 4-х раз.7. Инкубация с субстратной смесью. Во все лунки планшета вносят по 0,2 мл свежеприготовленного раствора Ы 4. Инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. В лунках,где прошла реакция, появляется желтое окрашивание разной степени интенсивности. Лунки первого контрольного ряда и лунки с отрицательной сывороткой должны оставаться бесцветными. в8. Реакцию останавливают добавлением во все лунки стрипов по 0,05 мл 50 И, раствора серной кислоты.Учет результатов проводят инструментально, на спектрофотометре типа Мультискан при длине волны 492 нм, установив режим на ЗВТОМЗТИЧССКИЙ ВЫЧЕТ ПОКЗЗЗТС лей оптической плотности (ОП) лунок 1-го ряда из показателей ОП исследуемых образцов.- ни один из показателей отрицательного контроля не превышает ОП 0,1 1- 0,05- показатели раствора Д превышают показатели отрицательного контроля не менее чем на 0,1.Оценку содержания специфических 15 Е-антител проводят на основе определения ОП продукта ферментативной реакции,характеризующей содержание специфических 13 Е-антитеп. для этого рассчитывают среднюю арифметическую ОП дублей растворов референс-реагент Р 2 и образцов тестируемых пищеваритеатьньпс секретов. ОП образцов сраввивахот с ОП растворов Р 2 (табл. 1).Так как содержание специфических 1 дЕ-антител в сыворотке крови и стопе пропорционально средним показателям оптической плотности исследуемых образцов, мы использовали единицу оптической плотности (ед.0 П) в качестве единицы измерения уровня специфических 13 Е-антител.Аналогичным образом определяют специфические 13 Е-антитела в сыворотке крови.Результаты статистического анализа по заявляемому способу приведены в таблице 2.Как видно из таблицы, частота выявления специфических ЩЕ-антител в слюне у детей с пищевой аллергией в 2,4 раза оказалась выше, чем в сыворотке крови. Отмечаетсявысокая достоверность выявленных результатов (Р 0,001).Определение оптической плотности (ОП) растворов референс-реагента Р 2 и оценка содержания дБ-антител в исследуемых секретах по степени реакции(51,4 ) антитела-реагины выявлены только в слюне и в 15 (10,9 ) только в сыворотке крови (Р 0,001). В слюне по сравнению с сывороткой крови достоверно чаще выявлялись ЩЕ-антитела к пищевым аллергенам а пределах высоких уровней (Р 0,01). Это свидетельствует о том, что антигенное раздражениеОП растворов ОП растворов реакции э Авызывает гиперпродукцию специфических 1 дЕ в секретах (слюне) в большей степени, чем в сыворотке крови.Учитывая, что использованные методы выявления антител-реагинов являются лабораторными тестами, мы сочли целесообразным сопоставить полученные результаты с данными анамнеза и реакции шанса лейкоцитов (РЛЛ)Частота положительных результатов ИФА сыворотки крови и слюны в зависимости от уровня сенсибилизацииНизкий уровень Умеренно высокий Высокий уровень уровень антителВсего положительных результатовЧастота соответствия результатов ИФА слюны данным анамнеза . ИФА сыворотки крови и РЛЛу детей при пищевой аллергии (в процентах)Отрицательные данные ИФА сыворотки кровид положитель- ОТРИЦНТЛЪ- положитель- отрицатель- ПОЛОЖИТСЛЬ- отргщатель ные вые ные вые ные внеИз таблицы видно, что степень соответствия мости молока и молочных продуктов. Это соразличных методов диагностики пищевой ал- стояние ряд исследователей относит к латентлергии зависит от вида сенсибилизации. Так, ной пищевой сенсибилизации (идш периоду в группе детей с молочной сенсибилизацией клинической толерантности). Ниже приводим частота положительных тестов при ИФА слю- 5 клинические примеры использования предлавы составила 63,6 . Исследование сыворотки гаемого способа. крови у детей с клинико-анамнестическими Пример 1. Ребенок Ваня Ш. 14 лет. Диагноз признаками аллергии к молоку позволило вы- клинический нейродермит, распространенная явить 1 дЕ-антитела только у 27,3 а поло- форма, период обострения. Бронхиальная астжительная реакция лизиса лейкоцитов 10 ма, атопическав форма, тяжелое течение, приотмечаласъ лишь у 9,1 . Таким образом, ступный период, ДНо. Хронический гастрит с диагностическая ценность последних двух ме- повышенной секреторной и кислотообразуютодов в диагностике пищевой аллергии оказа- щей функцией желудка в стадии обострения. лась относительно невысокой. Пищевая аллергия в анамнезе. На первом годуВ целом совпадение клинико-анамиестиче- 15 жизни наблюдались упорные срыгивания, жидских данных и положительных результатов кий стул после приема коровьего молока. При выявления 15 Е-антител в слюне к аллергенам запахе и употреблении в ПИШУ Рыбы развивакурииого яйца, рыбы и молока получено в 18 ются приступы удушья, усиливается зуд кожи. из 23 обследованных детей (78,3 ). В сыво- При приеме куриных яиц и мяса курицы отротке крови этот показатель был ниже в 1,8 20 мечается покраснение и зуд кожи. Данные раза и составил 43,5 И, (Р 0,01). У 4 детей аллергологического обследования скарификав анамнезе имелись указания на диспептиче- дневные кожные пробы с пищевыми аллергеские расстройства после приема цельного ко- нами отрицательные. При иммуноферментвом ровьего Молока (рвоту, жидкий стул), однако исследовании сыворотки крови специфические при ИФА слюны ЕЕ-антитела к аллергенам 25 пищевые Е-антитела не выявлены. При ИФА коровьего молока не были выявлены. При тща- слюны выявлены умеренно высокие и высокие тельном клинико-лабораторном обследовании уровни аллергенспецифических ЩЕ-автител к этих детей диагностирована дисахаридазная коровьему молоку - 0,947 ед.ОП (НЧ-Р), кунедостаточность по лактазному типу как одна риному ищу - 0,567 (н), мясу курицы - 0,460,из причин интолерантвости к молоку. Данный 30 мясу утки - 0,872 (-Н), хеку - 0,687 (Н-ъ),факт подтверждает высокую специфичность треске - 0,430 сайре - 0,425 ед.0 П (Н). способа диагностики пищевой аллергии путем Пример 2. Ребенок Оля Ш. 6 лет. Диагноз выявления специфических ЕЕ-автител в сшо- клинический нейродермит, распространенная не. У одного ребенка с сочетанными кожньпкш форма, период обострения. Поверхностный гаи гастроинтестиваягьнымв проявлениями ал- 35 стродуоденит с повышенной кислотообразуюлергии выявлен умеренно высокий уровень щей и сниженной секреторной функцией в 1 дЕ-антител к молоку в слюне и низкий в стадии обострения. Пищевая аллергия в анам сьтппотке крови на фоне хорошей пеоевоси- незе. На первом году жизни отмечались при