Способ диагностики гастроинтестинальной аллергии у детей

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ54 спосов ДИАГНОСТИКИ ГАСТРОИНТЕСТИНАЛЬНОЙ АЛЛЕРГИИ у ДЕТЕЙСпособ диагностики гастроинтестинальной аллергии у детей, включающий определение в слюне уровня иммуноглобулинов класса Е, отличающийся тем, что дополнительно определяют уровень секреторною иммуноглобулина А, затем рассчитывают соотношение первою показателя ко второму и при значении первою показателя 3,0 кЕ/ л и выше, снижения уровня второго показателя до 0,53 г/ л и ниже, а также ПРИ ЗНДЧЕНИЯХ ОТНОЩСНИЯ ЭТИХ ПОКЗЗЗТЛСЙ В пределах 693-1386 и более диагностируют алЛСРГИЧССКОС ПОРНЖВНИВ желудка И ДВВНЗДЦЗтиперстной кишки.(71) Заявитель Белорусский государственный институт усовершенствования врачей(73) Патентообладатель Белорусский государственный институт усовершенствованияИзобретение относится к медицине, а именно к области клинической иммунологии и аллергологии.Задачей способа является повышение точноСТИ ДИЗГНОСТИКИ ЗЛЛЕРГИЧВСКОГО ПОрЦЖЕНИЯ желудка и двенадцатиперстной кишки у детей с кожными и дермореспираторными проявлениями пищевой аллергии.Поражение органов пищеварения занимает центральное место в клинике пищевой аллергии. Выбор иммуноглобулинов класса Е и секреторных 13151, а также коэффициента их соотношения 15 Е/515 А обусловлен тем, что общий 1313 слюны является маркером аллергического процесса в пищеварительном тракте. а секреторный 13 А является основным компонен з ВУ 902 С 1 4том местной иммунологической защиты, в том числе от пищевых и иных видов аллергенов.Предлагаемый способ позволяет диагностировать аллергическое поражение желудка и двенадцатиперстной кишки в рагшие сроки до появления клинических симптомов заболевания), что важно для своевременного назначения патогенетической терапии и предупреждения прогрессирования болезни. Способ может быть использован для диагностики как типичных,так и стертых н латентных форм гастродуодеиальной патологии у детей на фоне измененной иммунологической реактивности.Способ осуществляют следующим образом.Ротоглоточный секрет (слюну) собирают утром в 7-8 часов Натощак, центрифугируют в течение 20 минут со скоростью 7000 об/ мин. Супернатант отсасывают, замораживают и хранят при температуре -20 С до момента исследования.Уровень общего 1 Е в слюне определяют иммуноферментным методом с использованием тест-систем отечественного производства(г. Ставрополь, НПО АлглергенЧ. Иммуноферментная тест-система состоит из следующих реагентовреагент 2 - (Р 2) конъюгат анти-ТБЕ-антител с пероксидазой хрена, прозрачный раствор желтоватого цвета, 0,6 мл во флаконереагент 3 - (РЗ) твин-20, прозрачный раствор желтого цвета 1,0 мл во флаконереагент 7 - (Р 7) лимонная кислота, порошок белого цвета кристаллическийреагент 8 - (Р 8) натрий лимоннокислый, порошок белого цвета аморфный.Перед постановкой реакции готовят следующие рабочие растворыЫ 91 - разводящий раствор 0,5 мл РЗ разводят в 1 л 0,9 И, раствора хлористого натрия,рН 7320, 1 Ч 92 - промывающий раствор - готовят аналогично разводящему раствору НеЫ 93 - рабочий раствор конъюгата Р 2 довести до объема 60 мл раствором М 91ММ раствор нитратного буфера Р 7 развести в 50 мл дистиллированной воды (раствор А) Р 8 развести в 50 мл дистиллированной воды (раствор Б) к 50 мл раствора Б Добавить 20 мл раствора А и довести им до рН 4,70,3Ы 95 - раствор индикатора Р 4 растворить в 60 мл раствора ММ из расчета на 3 планшетаПланшет освобождают от упаковки, маркируют. В каждую лунку первого ряда планшета(по вертикали) вносят по 0,2 мл раствора МЫ в качестве отрицательного контроля. В. лунки А и В второго и третьего рядов вносят по 0,2 мл стандарта иммуноглобулина Е с содержанием 100,0 кЕ/ л (положительный контроль). Затем в лунки В, С, Д и т.д. этих рядов вносят по 0,2 мл раствора Ы 91. Содержание лунок В тщательно перемешивают с помощью пипетки, 5 раз набирая и сбрасывая жидкость. После перемешивания содержимое лунок В второго и. третьегшрядов в кшшчестве .0,2 мл последовательно переносят в лунки С, из лунок С - в лунки Д и т.д., каждый раз аналогично перемешивая и осуществляя таким образом двухкратное разведение стандарта 1 Е от 100,0 кЕ/л до концентрации 0,8 кЕ/ л. Из последних лунок лишние 0,2 мл содержимого выбрасывают. Во все другие лунки вносят отдельной пипеткой цельные образцы исследуемых секретов в дубликатах. Планшет плотно закрывают крышкой и помещают в термостат при температуре 371 на 1 час для образования комплекса антитело-антиген. После инкубации производят отмывку планшета. Для этого удаляют отсасыванием жидкость из лунок, каждую лунку заливают доверху раствором 1 Ч 92 на 2-3 минуты, жидкость снова удаляют. Процедуру отмывания повторяют не менее трех раз. По окончании отмывки планшеты сушат фильтровальной бумагой. Затем в каждую лунку планшета вносят по 0,2 мл раствора конъюгата Ы 93. Планшеты закрывают крышкой и помещают в термостат при 3611 на 1 час. Повторяют процесс отмывки планшета не менее 5 раз. Готовят субстратную смесь ех тешроге. В каждую лунку отмытых планшетов вносят по 0,2 мл свежеприготовленной субстратной смеси. Инкубируют в течение 20-30 минут, в зависимости от интенсивности окрашивания, при комнатной температуре в защищенном от света месте. В лунках планшета, где прошла реакция, проявляется желтое окрашивание разной интенсивности. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку 0,05 мл 50 раствора серной кислоты. Учет результатов производят на фотометре Мцшзкап при длине волны 492 нм,установив режим прибора на автоматический вычет показаний оптической плотности контрольного первого ряда из показаний оптической плотности исследуемых образцов. Анаяшз считают действительным, если- ш один из показателей отргщатеггъною контроля не превышает оптическую плотность 0,1- ПОКЗЗЗТЛИ МЗКСИМНЛЬНОГО ПОЛОЖИТСЛЬНОГО контроля стандарт 13 Е в 100,0 кЕ/л) превышают оптическую плотность в 1,0.По калибровочной кривой на основании среднего показателя оптической плотности каждого образца вычисляют концентрацию общего ЕЕ в исследуемых секретах (рис. 1).Количественное определение секреторного иммуноглобулина А в слюне определяют методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини. Готовят 2-3 агар на 0,1 М веронал-мединаловом буфере рН 8,6. З мл расплавленного агара смешивают при 56 С с 3 мл сыворотки против секреторного 13 А, взятого в таком разведении, чтобы конечная концентрация соответствовала рабочему разведению,укааанномлу на этикетке. На пластины 710 см помещают латунную П-образную рамку толщиной 1 мм, а сверху - вторую стеклянную пластинку, смазанную гидрофобной жидкостью.На рис. 1 показан расчет содержания общего 13 Е в слюне с помощью калибровочной кривой.пунктиром показан расчет общего 13 Е при средней оптической плотности, равной 0,486.Пластины скрепляют зажимами и в пространство между пластинами заливают 6 мл приготовленной смеси агара с антисывороткой. После застывания смеси зажимы снимают,рамку и стеклянную пластину убирают и в слое агара пробойником выбивают лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. В лунки микрошприцем вносят по 2мкл стандарта - очищенного секреторного иммуноглобулина А с концентрацией белка 2 мг/мл в разведения) 11 12 14 18 и исследуемые секреты. Пластину инкубируют во влажной камере 24 часа при комнатной температуре 120. По окончании инкубации пластины промывают 2 дня физиологическим раствором и красят амидочерным. Диаметр колец преципитации измеряют с точностью до 0,1 мм циркулем измерителем, шкалой с иониусом или специальной линейкой, выпускаемой фирмой Берингверке. Содержание секреторного иммуноглобулина ААЫЕА) в исследуемых образцах определяют относительно стандарта с известной концентрацией секреторного иммуноглобулина А. По миллиметровой бумаге строят калибровочную кривую,откладывая на оси ординат квадраты радиусов колец преципитации в мм, полученные с разными разведениями стандарта, а на оси абсцисс - соответствующие этим кольцам концентрации стандарта - секреторного ША в мг/ кл.На рис. 2 показан расчет содержания секреторного иммуноглобулина А в слюне с помощью калибровочной кривой, построенной по стандарту - очищенному зЕА.пунктиром показан расчет 313 А в слюне при диаметре кольца преципитации, равном 5,4 мм.Результаты статистического анализа по данному способу приведены в таблицах 1-3.Содержание общих иммуноглобулинов Е в слюне у обследованных детейС воспалительными забоЛВВННИЯМИ желудка И ДВЕ надцатиперстной кишкиБез заболеваний желудка и дв енадцатиперстной кишкиПримечание. В таблицах 1-3 значения Р рассчитаны по сравнению с группой детей без заболеваний 1С воспалительными заболеваниями желудка и две 29 0 надцатиперстной кишкиБез заболеваний желудка и двенадцатиперстной 21 3 кишкиС воспалительными заболеваниями желудка и две- 18 надцатиперстной кишкиБез заболеваний желудка и двенадцатиперстной 18 кишкиЗдоровые дети контрольная группа)Клинические примеры использования предлагаемого способа.Пример 1. Ребенок Виталий Р., 12 лет. Диагноз при поступлении Нейродермит, распространенная форма, период обострения. Пищевая и медикаментозная аллергия. Неврит слухового нерва.Страдает аллергическими колошмн проявлениями с рождения. Болей в животе, диспептических нарушений не отмечается. При осмотре язьп густо обложен беглым налетом. Живот мягкий, умеренно болезненный в эгшгастралтзной области. Печень у края правой реберной душ. Данные иммунологического исследования общий Е слюны - 4,1 кЕ/л, секреторный ТнА слюны - 0,57 г/л, 1 дЕ/з 1 дА - 7,19.Результаты объективного исследования свидетельствуют о наличии патологии органов пищеварения. Для уточнения диагноза проведена гастрофиброскопия и фракционное исследование желудочного сока. Выявлен антральный гипертрофический гастрит, поверхностный дуоденит с повышенной кислотообразующей и сохранной секреторной функцией желудка.Пример 1 является убедительным доказательством информативности определения уровТаблица 3 Коэффициент соотношения общих иммуноглобулинов Е к секреторному иммуноглобулину Аней общего иммуноглобулина Е и секреторного иммуноглобулина А в слюне, а также показателя их соотношения у детей с патентными и стертыми формами патологии желудка и двенадцатиперстной кишки.Пример 2. Ребенок Слава И., 11 лет. Диагноз при поступлении Нейродермит, распространенная форма, период обострения. ПоллинозСтрадает аллергодерматозом в течение 9 лет,поллинозом - 2 года. С 5 летнего возраста периодически беспокоят боли в верхних отделах живота, тошнота, склонность к запорам. При осмотре язык обложен белым налетом. Живот мягкий, отмечается умеренно выраженная болезненность в эпигастральной области. Печень у края правой реберной дуги.Данные иммунологического исследования общий 15 Е слюны 4,8 кЕ/л, 513 А слюны 0.58 г/л, 15 Е/51 дА - 8,28.Полученные результаты свидетельствуют о вовлечении в патологический процесс органов пищеварения. Для уточнения характера и локализации поражения проведена фиброгастроскопия. Выявлен антральный