Способ прогнозирования риска рецидива злокачественной опухоли

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РЕЦИДИВА ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр детской онкологии и гематологии и иммунологии(72) Авторы Савицкая Татьяна Владимировна Киселев Леонид Петрович Липай Наталья Валерьевна Алейникова Ольга Витальевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр детской онкологии и гематологии и иммунологии(57) Способ прогнозирования риска рецидива злокачественной опухоли, заключающийся в том, что в образце опухоли оценивают уровень экспрессии генов -2, 165 и 189, рассчитывают коэффициент 165/189 и прогнозируют высокий риск развития рецидива опухоли при значении уровня экспрессии гена -2 менее 0,8 и значении коэффициента 165/189 менее 0,9 или низкий риск развития рецидива опухоли при значении уровня экспрессии гена -2, равном или более 0,8, и/или значении коэффициента 165/189, равном или более 0,9. Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, а именно к способу определения молекулярных маркеров ангиогенеза как факторов прогноза риска рецидива у пациентов со злокачественными солидными опухолями. Ангиогенез - процесс роста новых сосудов, регулируемый рядом клеточных факторов. Он является необходимым условием для роста опухоли и метастазов, поэтому ингибирование процессов опухолевого ангиогенеза - многообещающий подход к лечению онкологических заболеваний. Так как молекулярные маркеры (мРНК) ангиогенеза также экспрессируются в здоровом организме, то для определения уровня их экспрессии при патологии и клинического использования необходим количественный метод. Известны способы определения молекулярных маркеров ангиогенеза с применением технологии количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с использованием в качестве маркеров уровней экспрессии мРНК ряда факторов, регулирующих ангиогенез 1, 2. Авторами показана корреляция между уровнем мРНК ангиогенных факторов и опухолевой прогрессией, временем возникновения рецидива и выживаемостью пациентов. 18697 1 2014.10.30 Недостатком является недостаточная клиническая значимость способов, связанная как с особенностями патогенеза исследуемого вида опухоли, так и с прогностической значимостью выбранных маркеров. Наиболее близким, принятым за прототип, является способ определения экспрессии мРНК маркера ангиогенеза фактора роста эндотелиальных клеток , а именно его транскриптов (сплайс-вариантов) 165, 189 и(теломеразной обратной транскриптазы) в карциноме молочной железы и неопухолевой ткани 3. В работе определяли экспрессию транскриптов методом количественной ПЦР с использованиемтехнологии. Проанализированы уровни соотношений (коэффициентов) экспрессии транскриптов 165/189 и , показаны различия в экспрессии в опухолевой и неопухолевой ткани, однако авторы не оценили прогностическую значимость способа и комбинации нескольких маркеров у онкологических пациентов. Задача настоящего изобретения - создание комбинации молекулярных маркеров ангиогенеза для прогноза риска рецидива злокачественной опухоли у пациента. Поставленная задача достигается тем, что для осуществления способа используют образец опухолевой ткани пациента со злокачественной опухолью. В нем определяют экспрессию генов (мРНК) ингиботора пути тканевого фактора (-2,) и транскриптов фактора роста сосудов (,) 165 и 189 на момент постановки диагноза методом относительной количественной ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени. Комплексное сочетание уровней этих двух маркеров позволяет определить у пациента группу риска развития рецидива. Способ осуществляется следующим образом. Из образцов опухолевой ткани пациента выделяют РНК, на которой в реакции обратной транскрипции синтезируют кДНК. Полученную кДНК используют в качестве матрицы в реакции относительной количественной ПЦР. Принцип выполнения методики относительной количественной ПЦР заключается в следующем в каждом образце мишенями являются мРНК (конвертируемые в кДНК) изучаемых генов, а референс-геном - кДНК гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (, 3- ) мишень и референс-ген амплифицируют в отдельных пробирках для получения относительных стандартных кривых используют метод стандартных разведений. Стандартные кривые в каждой реакции для каждого гена строят по четырем 10-кратным разведениям кДНК (от 100 до 10-3), полученным из перевиваемых клеточных линийдля генов -2 идля , 165 и 189. Полученные стандартные кривые используют для расчета относительного количества продуктов амплификации исследуемых генов ис учетом эффективности реакции. Стандартные кривые оценивают математически с использованием программного обеспечения термоциклера для ПЦР в реальном времени по следующим показателям коэффициент корреляции ( ), который отражает корреляцию показателя СТ разных разведений и должен быть выше 0,990 эффективность ПЦР ( ) должна быть в пределах 90-110 наклон стандартной кривойможет варьировать в пределах 3,0-3,6. Для амплификации гена -2 и референс-генаиспользуют праймеры и зонды в виде коммерческих наборов (,,США). Для амплификации сплайс-вариантов 165 и 189 используют пробы и праймеры, указанные в работе. 4. Для ПЦР используют набор для проведения количественной ПЦР с применениемтехнологии, в состав которого входит фермент урацилгликозилаза, позволяю 2 18697 1 2014.10.30 щий предотвратить повторную реамплификацию продуктов при перекрестной контаминации продуктов ПЦР. Собственно ПЦР проводят, используя следующие условия 20 - 10 мин, 42 - 45 мин,99 - 3 мин. Количество циклов - 50. Амплификацию и уровень экспрессии гена определяют с использованием прибора и программного обеспечения(, США). Программное обеспечение используемого прибора на основе построенной стандартной кривой рассчитывает ненормализованные уровни экспрессии генов, выраженные в условных единицах. Нормализуют значения экспрессии исследуемых генов делением на значение экспрессии референс-гена 2 ИГнИГх/,где ИГн - нормализованное значение экспрессии исследуемого гена в образце ИГх ненормализованное значение экспрессии исследуемого гена в образце- значение экспрессии референс-гена в образце. Определяют коэффициент 165/189 делением нормализованного значения экспрессии сплайс-варианта 165 на значение нормализованного значения экспрессии сплайс-варианта 189. При комплексном сочетании этих двух признаков в качестве факторов прогноза риска рецидива определяют группы прогноза при одновременных значениях -2 менее 0,8 значение коэффициента 165/189 менее 0,9 - плохой прогноз при значениях -2 более или равно 0,8 и/или значение коэффициента 165/189 более или равно 0,9 - хороший прогноз. Преимуществом заявляемого способа является возможность клинического использования, так как для его выполнения применяют оборудование и технологии, широко используемые в современных диагностических лабораториях. Отличительные признаки заявляемого в качестве изобретения способа использование комбинации двух факторов -2 и 165/189 использование в качестве одного из двух факторов коэффициента соотношений 165/189 определение конкретных уровней экспрессии мРНК используемых факторов. Предлагаемый способ позволяет выявлять группы риска развития рецидива среди детей со злокачественными опухолями, в первую очередь у пациентов с локальной формой заболевания,назначать дополнительное лечение, обоснованно использовать таргетную терапию у пациента с локальной формой заболевания, но группой высокого риска модифицировать план лечения для пациента из группы высокого риска на ранних этапах, что позволяет индивидуализировать терапию и увеличить показатели безрецидивной выживаемости. Эффективность применения способа иллюстрируется следующими фигурами. На фиг. 1 приведена безрецидивная выживаемостьсреди детей со злокачественными опухолями (костными и мягкотканными). Для группы высокого риска 1 (по критериям 0,8 -20,9 165/189) она составила 23,08,0 против 80,09,0 для группы низкого риска 2 ( 0,8 -2 и/или 0,9 165/189)(р 0,00008). При этом первую группу составили 26 пациентов, из них 16 с рецидивом,без рецидива - 10, медиана наблюдения составила 13,65 мес. Во вторую группу вошли 21 пациент, без рецидива - 19, с рецидивом - 2, медиана наблюдения - 24,45 мес. На фиг. 2 приведена безрецидивная выживаемость среди детей с костными опухолями(саркомой Юинга и остеогенной саркомой) и локальной формой заболевания. Для группы высокого риска 1 (по критериям 0,8 -20,9 165/189) она составила 41,013,0 против 90,08,0 для группы низкого риска 2 ( 0,8 -2 и/или 3 18697 1 2014.10.300,9 165/189) (р 0,0235). Первую группу составили 14 пациентов, из них 6 с рецидивом, без рецидива - 8, медиана наблюдения составила 14,03 мес. Во вторую группу вошли 13 пациентов, без рецидива - 12, с рецидивом - 1, медиана наблюдения составила 23,05 мес. На фиг. 3 приведена безрецидивная выживаемость среди детей с саркомой Юинга и локальной формой заболевания. Для группы высокого риска 1 (по критериям 0,8 20,9 165/189) она составила 40,019,0 против 100,000,0 для группы низкого риска 2 ( 0,8 -2 и/или 0,9 165/189) (0,0377). Первую группу составили 7 пациентов, из них 3 с рецидивом, без рецидива - 4, медиана наблюдения 14,03 мес. Во вторую группу вошли 128 пациентов, без рецидива - 128, с рецидивом - 0,медиана наблюдения составила 23,05 мес. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5