Селективная среда для импедиметрического выявления патогенных бактерий рода Salmonella в продовольственном сырье и пищевых продуктах

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СЕЛЕКТИВНАЯ СРЕДА ДЛЯ ИМПЕДИМЕТРИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ РОДАВ ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(72) Авторы Дудчик Наталья Владимировна Половинкин Леонид Васильевич(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(56)9567 1, 2007. Среда Раппапорта-Василиадиса, 2010,///11371137/.9187 1, 2007.5843699 , 1998.2192461 1, 2002.... - 1991. - . 13. - Р. 287-290.... - 1998. - . 84. - Р. 399-403.1758076 1, 1992.2233884 2, 2004. ГОСТ 30519-97. Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода .2233885 2, 2004.(57) Селективная среда для импедиметрического выявления патогенных бактерий родав продовольственном сырье и пищевых продуктах, содержащая дрожжевой экстракт, триметиламина оксид дигидрат, биселенит натрия и воду дистиллированную,отличающаяся тем, что дополнительно содержит гидролизат казеина, натрия хлорид, калия дигидрофосфат, магния хлорид шестиводный и малахитовый зеленый при следующем соотношении компонентов дрожжевой экстракт, г 1,0-1,5 триметиламина оксид дигидрат, г 0,6-1,0 биселенит натрия, г 0,8-0,9 гидролизат казеина, г 4,0-5,0 натрия хлорид, г 7,0-7,5 калия дигидрофосфат, г 1,6-1,7 магния хлорид шестиводный, г 20,0-40,0 малахитовый зеленый, г 0,03-0,04 вода дистиллированная, л 1,0,и имеет 5,60,4. 18614 1 2014.10.30 Изобретение относится к разделу санитарной микробиологии и гигиены питания. Выявление патогенных бактерий, основанное на импедиметрическом принципе детекции, является перспективным инструментальным экспресс-методом лабораторной диагностики в санитарной микробиологии. Основным критерием оценки результатов выявления является регистрация изменений электрохимических параметров селективной среды в результате развития детектируемых микроорганизмов при оптимальной температуре культивирования. Поэтому принципиальным моментом при выполнении диагностики патогенов с импедиметрическим принципом детекции является оптимизация среды культивирования, состав которой обеспечивает рост детектируемого микроорганизма с одновременными изменениями электрической проводимости среды. Основным требованием к селективной среде культивирования является обеспечение качественной кривой роста, которая должна отвечать следующим параметрам стабильная базовая линия выраженная фаза быстрого роста культуры (-период) высокое значение изменений электрохимических показателей среды. Известна дифференциально-диагностическая среда Раппапорта-Василиадиса для выявления бактерий родав продовольственном сырье и пищевых продуктах, в состав которой входит, г/л гидролизат казеина - 5,0, натрия хлорид - 8,0, калия дигидрофосфат - 1,6, магния хлорид шестиводный - 40,0, малахитовый зеленый - 0,04,5,20,2 1. Указанная среда является прототипом по отношению к заявленной. Общими признаками для заявленной среды и прототипа является то, что в состав обеих сред входит гидролизат казеина, натрия хлорид, калия дигидрофосфат - 1,6, магния хлорид шестиводный - 40,0, малахитовый зеленый - 0,04. Однако среда-прототип используется для выявления бактерий родакультуральным методом и не обеспечивает требуемых параметров кривой роста при импедиметрическом исследовании. Кроме того, среда-прототип не позволяет надежно дифференцировать бактерии родаот сопутствующей микрофлоры вследствие недостаточной селективности состава. Задачей заявляемого изобретения является повышение селективности среды по отношению к бактериям родас одновременным ингибированием роста сопутствующей микрофлоры и обеспечение параметров кривой роста выявляемого микроорганизма, достаточных для импедиметрического исследования. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложена селективная среда для импедиметрического выявления патогенных бактерий родав продовольственном сырье и пищевых продуктах, содержащая дрожжевой экстракт, триметиламина оксид дигидрат, биселенит натрия и воду дистиллированную, при этом дополнительно содержит гидролизат казеина, натрия хлорид, калия дигидрофосфат, магния хлорид шестиводный и малахитовый зеленый при следующем соотношении компонентов дрожжевой экстракт, г 1,0-1,5 триметиламина оксид дигидрат, г 0,6-1,0 биселенит натрия, г 0,8-0,9 гидролизат казеина, г 4,0-5,0 натрия хлорид, г 7,0-7,5 калия дигидрофосфат, г 1,6-1,7 магния хлорид шестиводный, г 20,0-40,0 малахитовый зеленый, г 0,03-0,04 вода дистиллированная, л 1,и имеет 5,6,0,4. 18614 1 2014.10.30 Предложенная среда содержит в своем составе в качестве источника органического азота, фосфора и углерода наряду с гидролизатом казеина также дрожжевой экстракт и обогащена двумя селективными агентами - триметиламин оксидом ТМАО и биселенитом натрия. На основании проведенных исследований заявителем установлено, что добавка к среде-прототипу селектирующего агента биселенита натрия в количестве 0,8-0,9 мг на 1000 см 3 ингибирует рост бактерий родов , , ,семейства , а также рода , не влияя на рост бактерий рода. Внесение в среду дигидрата триметиламина оксида в количестве 0,6-1,0 г на 1000 см 3 обеспечивает синергический эффект двух селективных агентов - биселенита натрия и триметиламин оксида, а также обеспечивает значительный рост электрохимических показателей среды при импедиметрической детекции при развитии в среде детектируемых бактерий рода . Также установлено, что значениесреды является критическим для обеспечения ингибирующего эффекта двух селективных агентов и должно находиться в интервале 5,6,0,4. Внесение в среду в качестве источника органического азота, фосфора и углерода наряду с гидролизатом казеина также дрожжевого экстракта обеспечивает присутствие азотистых питательных веществ, витаминов группы В, углерода, серы, микроэлементов и других веществ, что приводит к стимулированию роста сальмонелл и усиливает импедиметрический сигнал при детектировании. Проведенная заявителем оптимизация состава среды позволяет обеспечить необходимые параметры кривой роста бактерий рода , достаточных для импедиметрического исследования, с одновременным ингибированием роста сопутствующей микрофлоры. На фигуре представлены кривые роста микроорганизмов на среде оптимизированного состава, полученные с использованием импедиметрической детекции роста выявляемых патогенов, где по оси абсцисс отмечен показатель времени детекциив часах, а по оси ординат - изменение электрохимических показателей среды в процентах. Видно, что предложенная среда позволяет селективно выявить бактерии родав течение 2,5 ч, при этом среда предложенного состава ингибирует рост бактерий родов , , относящихся к семействуи близких кпо ряду морфологических, физиологических и биохимических признаков, а также бактерий рода . Пример приготовления среды. Для приготовления модифицированной среды Раппапорта-Василиадиса растворяют в 1000 см 3 дистиллированной воды следующие компоненты 4,0 г гидролизата казеина, 1,0 г дрожжевого экстракта, 7,0 г натрия хлорида, 1,6 г калия дигидрофосфата, 40,0 г магния хлорида шестиводного, 0,04 г малахитового зеленого - и стерилизуют автоклавированием при температуре (1211) С в течение 15 мин. Затем в среду асептически вносят 1,0 г дигидрата триметиламина оксида и 0,9 г биселенита натрия. Доводятдо 5,6,0,4. Выявлениепроводят в лабораторных образцах, искусственно контаминированных музейными штаммами бактерий родов , , а также изолятами, выделенными в результате мониторинга пищевых продуктов и объектов среды технологического окружения пищевых производств. Конечное содержание микроорганизмов в образце - 103 клеток/мл. Выявление проводят с использованием микробиологического анализатора с импедиметрическим принципом детекции. Результаты выявления приведены в таблице. Время детекции роста штамма, час Среда-прототип Оптимизированная среда 7,2 2,4 2,4 нет сигнала (не выявлен)8090 нет сигнала (не выявлен)8100 нет сигнала (не выявлен). нет сигнала (не выяв 13883 лен)8739 26,4 (ложноположительный результат)29212 нет сигнала (не выявлен) Из данных таблицы следует, что время детекции бактерий родана оптимизированной среде составляет 2,2-2,4 ч, что в 3,3-3,6 раза меньше, чем на среде-прототипе. Количество ложноположительных результатов на среде-прототипе в 5 раз больше, чем на среде предложенного состава. Таким образом, достигаемый технический результат заявляемого изобретения заключается в том, что оптимизированный состав среды, в т. ч. добавка двух селектирующих агентов - биселенита натрия и дигидрата триметиламина оксида - при значении 5,6,0,4, а также обогащение среды дрожжевым экстрактом в качестве источника органического азота, фосфора и углерода обеспечивают высокий уровень селективности среды для выявления патогенных бактерий родав продовольственном сырье и пищевых продуктах. Предложенная среда может быть использована также и при выявлении бактерий родакультуральным методом, что расширяет ее применение в практике работы лабораторий, осуществляющих контроль показателей безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Источники информации 1. Среда Раппапорта-Василиадиса. Электронный ресурс. - Режим Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5