Способ флуориметрического определения рибофлавина в кормах, продовольственном сырье или пищевых продуктах

(51)01 21/64 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИБОФЛАВИНА В КОРМАХ, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ ИЛИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(72) Авторы Шуляковская Ольга Васильевна Белышева Людмила Леонидовна Застенская Ирина Алексеевна Воронцова Ольга Сергеевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(56) Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов. - М. Брандес, Медицина, 1998. С. 156-161. Витамины. - Киев Издательство Академии наук УССР, 1953. - С. 51-57. Экспериментальная витаминология. Мн. Наука и техника, 1979. - С. 224-251. ГОСТ 30627.6-98. Продукты молочные для детского питания. Метод измерений массовой доли витамина В 2 (рибофлавина).(57) Способ флуориметрического определения рибофлавина в кормах, продовольственном сырье или пищевых продуктах, включающий кислотный и ферментативный гидролиз исследуемого образца, экстракционную очистку гидролизата от примесей, облучение рибофлавина в люмифлавин в щелочной среде, экстракцию люмифлавина, измерение интенсивности флюоресценции люмифлавина в сравнении со стандартным раствором и вычисление содержания рибофлавина, отличающийся тем, что в качестве фермента для ферментативного гидролиза используют такадиастазу. Изобретение относится к медицине, к разделу лабораторной диагностики, а также сельскому хозяйству и пищевой промышленности. Известен способ определения рибофлавина в молочных продуктах для детского питания путем кислотного гидролиза исследуемых образцов с их последующей ферментацией ферментами амилоризином или пектофоэтидином, очисткой фильтрата от примесей и щелочного облучения фильтрата для перевода рибофлавина в люмифлавин, экстракции люмифлавина и измерении интенсивности флюоресценции последнего 1. Способ является аналогом по отношению к заявляемому. Однако указанный способ имеет недостатки. Во-первых, ограничено определением тиамина только в молочных продуктах. Во-вторых, ферментный гидролиз проводится в течение 14-16 ч, что удлиняет время определения. 8338 1 2006.08.30 Известен способ флуориметрического определения рибофлавина в пищевых продуктах путем проведения кислотного и ферментативного гидролиза, экстракционной очистки полученного гидролизата от соединений, мешающих флуориметрическому определению,щелочного облучения рибофлавина в люмифлавин, экстракции люмифлавина и измерения интенсивности флюоресценции люмифлавина в сравнении со стандартным раствором с помощью флуориметра 2. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Однако к недостаткам известного способа относится длительное время проведения ферментативного гидролиза (14-16 ч), что усложняет определение рибофлавина (удлиняет время анализа,увеличивает расход электроэнергии и трудозатраты). Задачей заявляемого изобретения является сокращение времени ферментативного гидролиза. Поставленная задача достигается следующим образом. Представлен способ флуориметрического определения рибофлавина в кормах, продовольственном сырье или пищевых продуктах, включающий кислотный и ферментативный гидролиз исследуемого образца, экстракционную очистку гидролизата от примесей, облучение рибофлавина в люмифлавин в щелочной среде, экстракцию люмифлавина, измерение интенсивности флюоресценции люмифлавина в сравнении со стандартным раствором и вычисление содержания рибофлавина, при этом в качестве фермента для ферментативного гидролиза используют такадиастазу. Пример 1. Определение рибофлавина (витамина В 2) в пищевых продуктах. 1. Кислотный гидролиз. Навеску продукта 6,0-8,0 г помещают в колбу вместимостью 250 см 3 и приливают 150 см 3 соляной кислоты концентрацией 0,1 моль/дм 3. Гидролиз осуществляют на кипящей водяной бане в течение 40 мин. По окончании гидролиза колбу с содержимым охлаждают до температуры 18-25 С, добавляют 5-7 см 3 насыщенного раствора натрия уксуснокислого и 1 см 3 толуола. 2. Ферментативный гидролиз. К полученной по п. 1 смеси добавляют 5 см 3 2 -ного раствора такадиастазы и помещают в термостат, где выдерживают 3 ч при температуре (501) С. После этого гидролизат охлаждают до 18-25 С. 3. Очистка гидролизата. Полученный по п. 2 гидролизат переносят в мерную колбу вместимостью 250 см 3, доводят до метки дистиллированной водой и фильтруют. К 100 см 3 полученного фильтрата добавляют 2 см 3 раствора серной кислоты концентрацией 0,3 г/см 3 и с помощью пипетки или бюретки по каплям раствор марганцевокислого калия концентрацией 0,03 г/см 3 до получения малинового окрашивания. Избыток марганцевокислого калия удаляют добавлением по каплям раствора перекиси водорода, количество растворов серной кислоты, марганцевокислого калия и перекиси водорода (в см 3) приплюсовывают к первоначальному объему фильтрата, взятого на окисление. Полученный раствор переносят в делительную воронку, добавляют 30-50 см 3 хлороформа и встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев хлороформенный слой (нижний) отбрасывают, а водную фазу используют для дальнейшего определения. Аналогично готовят контрольную пробу на содержание рибофлавина в такадиастазе,используя то же количество ферментного препарата и реактивов, но без исследуемой пробы. 4. Облучение рибофлавина в щелочной среде. Облучение рибофлавина в щелочной среде проводят в 5 конических колбах с притертыми пробками. В 4 колбы наливают по 20 см 3 очищенного гидролизата, в две из которых добавляют по 2 см 3 рабочего стандартного раствора рибофлавина концентрацией 1 мкг/см 3. 2 8338 1 2006.08.30 В 5-ю колбу наливают 20 см 3 контрольной пробы. Во все 5 колб добавляют по 4 см 3 раствора гидроокиси натрия концентрацией 7 моль/дм 3,закрывают колбы пробками, перемешивают содержимое и облучают их светом двух светильников с лампами накаливания по 100 Вт каждая с расстояния 30 см в течение 40 мин. Температура окружающего воздуха должна быть не более 25 С. Для поддерживания указанной температуры воздуха используют настольный вентилятор. 5. Экстракция. Сразу же после окончания облучения растворы во всех колбах подкисляют 4 см 3 ледяной уксусной кислоты, добавляют к ним по 20 см 3 хлороформа, закрывают притертыми пробками и встряхивают в течение 2 мин, избегая образования эмульсий. Затем все колбы оставляют на 10-15 мин для расслоения водной и хлороформенной фаз. После этого пипеткой отбирают по 10-12 см 3 хлороформенного раствора (нижний слой), который фильтруют через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия в флуориметрические пробирки. 6. Измерение интенсивности флюоресценции люмифлавина. Интенсивность флюоресценции люмифлавина измеряют при светофильтрах, дающих диапазон длины волн возбуждения в области 350-480 нм и флюоресценции - 475-650 нм. Контролем служит хлороформ. 7. Обработка результатов. Содержание рибофлавинав мг на 100 г продукта вычисляют по формуле,21310 где А - среднее из показаний флуориметра для испытуемой пробы без добавления стандартного раствора рибофлавина, ед. прибора В - среднее из показаний флуориметра для испытуемой пробы с добавлением стандартного раствора рибофлавина, ед. прибора С - показание флуориметра для контрольного опыта на реактивы, ед. прибора- общий объем гидролизата, см 3 1 - объем гидролизата после окисления, см 3 2 - объем гидролизата, взятый для окисления, см 3 3 - объем гидролизата, взятый для облучения, см 3 М - масса добавленного рибофлавина, мкг 1 - масса пробы продукта, взятой для анализа, г 10 - пересчет из мкг/г в мг на 100 г продукта. Вычисления проводят с точностью до третьего десятичного знака с последующим округлением до второго десятичного знака. За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений. Результаты определения рибофлавина в пищевых продуктах предлагаемым способом представлены в таблице. Определение рибофлавина в пищевых продуктах Способ определения Известный (по прототипу) Предлагаемый Пример 2. Определение рибофлавина (витамина В 2) в кормах. Определение рибофлавина в кормах проводится аналогично примеру 1. 3 8338 1 2006.08.30 Пример 3. Определение рибофлавина (витамина В 2) в продовольственном сырье. Определение рибофлавина в продовольственном сырье проводится аналогично примеру 1. Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемый способ обладает следующими преимуществами сокращает время ферментативного гидролиза в 4-5 раз повышает на 5 точность определения заменяет дефицитные ферменты (амилоризин и пектофоэтидин П 10 ), используемые в прототипе, на такадиастазу. Источники информации 1. ГОСТ 30627.6-98 Продукты молочные для детского питания. Метод измерения массовой доли витамина В 2 (рибофлавина). Введ. 01.05.2000. - Мн. Изд-во стандартов, 1999. С. 8 (аналог). 2. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. -М. Брандес, Медицина, 1998. - С. 156-161 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4