Штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней Porcine reproductive and respiratory syndrome virus КМИЭВ-V112 – штамм-антиген

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Згировская Алла Александровна Гусев Анатолий Алексеевич Ломако Юрий Васильевич Минчук Юлия Николаевна Пунтус Ирина Анатольевна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56)2124051 1, 1998. СОКОЛОВ М.А. Биологические свойства штаммов вируса репродуктивнореспираторного синдрома свиней Автореф. дис. - М., 2004. - С. 3-23. ЯСТРЕБОВ А.С. и др. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины. 2004. - Т. 40. - Ч. 1. - С. 333-335.10947, 2008.2192887 2, 2002.2166327 2, 2001.2003129068 , 2005.(57) Штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свинейКМИЭВ-112 - штамм-антиген. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к биотехнологии, и может быть использовано для создания вакцин с высокой иммуногенностью. Известен штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) КПР-96. Штамм получен путем серийных пассажей на трехсуточной культуре клеток-145, являющейся клоном культуры клеток МА-104 (почка эмбриона макаки-резус). Титр вируса 6 пассажа составляет 5,17 ТЦД 50/см 3. Штамм является слабовирулентным для свиней и используется для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов 1. Недостатком данного штамма является его отличие по антигенным и иммунобиологическим свойствам от циркулирующих штаммов на территории Республики Беларусь. Наиболее близким аналогом штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней европейского генотипа является штамм . Таксономическая принадлежность. Вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней штаммаотносится к семейству , роду . 18555 1 2014.08.30 Культурально-морфологические признаки. Вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней штаммарепродуцируется в культуре клеток линий РК 2, РК-15,-6 и свиных легочных макрофагах. Морфологические признаки. Это РНК-содержащий вирус. Геном состоит из одной молекулы линейной позитивной одноцепочечной РНК размером от 14500 до 15500 оснований. Форма вириона шарообразная. Частицы характеризуются диаметром 45-55 нм и содержат нуклеокапсид размером 3035 нм, который окружен липидной двухслойной мембраной. Вирулентность. Максимальный титр вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней штаммасоставляет 5,5 ТЦД 50/см 3. Иммуногенность. Штамм вирусаявляется иммуногенным, так как способствует выработке антител после введения животным 2. Недостатком данного штамма является его низкий титр и, как следствие этого, сравнительно низкая иммуногенность. Задачей настоящего изобретения является выделение и селекция штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, обладающего высоким титром и, как следствие, высокой иммуногенностью,который может быть использован для конструирования диагностических и вакцинных препаратов. Поставленная цель достигается тем, что в качестве штамма-антигена был выделен и селекционирован штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней- штамм-антиген, обладающий высокой биологической и, как следствие, высокой иммуногенной активностью. Штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС)депонирован в коллекции микроорганизмов РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского 26 июня 2009 года. Коллекционный номер КМИЭВ-112. Таксономическая принадлежность. Вирус относится к семейству , роду. Культурально-морфологические признаки. Вирус РРСС штамма КМИЭВ-112 успешно репродуцируется в легочных альвеолярных макрофагах (АМФ) поросят и перевиваемой культуре клеток -145 (клон, полученный из культуры клеток МА-104 почки эмбриона макаки-резус). Морфологические признаки. Это РНК-содержащий вирус. Геном состоит из одной молекулы линейной позитивной одноцепочечной РНК размером около 15 000 нуклеотидов. Форма вириона шарообразная, размер вириона 45-75 нм с ядром, занимающим 3/4 вириона диаметром 25-35 нм, окружен липидной оболочкой. Физико-биохимические свойства. Неустойчив к эфиру, хлороформу и детергентам. Чувствителен к формальдегиду, ультрафиолетовому облучению, гамма-облучению, высыханию и к изменениюсреды. Оптимумот 5 до 7. При низких температурах (-70 С) и в лиофилизированном состоянии сохраняется до 2 лет, при 4 С - 1 месяц, при 37 С 2-е суток. При температуре 55 С он инактивируется в течение 45 мин. Молекулярно-биологические признаки. Штамм КМИЭВ-112 является РНКгеномным вирусом. 5-конец РНК кэпирован, а 3-конец полиаденилирован. Ген капсидного белка расположен на 3-концевой части генома. Геном штамма КМИЭВ-112, как и все другие штаммы и изоляты вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней,содержит восемь открытых рамок считывания (ОРС), которые кодируют гены репликаз(ОРС 1 а и 1 в), оболочесные белки (ОРС 2-6) и нуклеокапсидный белок (ОРС 7). Определены 6 структурных белков вируса РРСС и их соответствующих генов. Маркерные признаки. Идентификацию вируса РРСС проводили методом ПЦР в реальном времени. 2 18555 1 2014.08.30 Онкогенность. Штамм вируса КМИЭВ-112 не является онкогенным. Данные о контаминации. Штамм вируса КМИЭВ-112 не контаминирован бактериальной и грибковой микрофлорой, а также другими вирусами. Антигенная активность. Через 21 сутки после вакцинации поросят в сыворотках крови выявляются антитела к вирусу РРСС в пределах 2,1-5,3. Безвредность. Штамм вируса КМИЭВ-112 не реактогенен для свиней. Вирулентность. Штамм вируса КМИЭВ-112 является слабовирулентным для свиней. Биологическая активность. Титр вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней КМИЭВ -112 составляет 5,8-6,0 ТЦД 50/см 3. Иммуногенность. Штамм вируса КМИЭВ-112 является иммуногенным, поскольку через 21 сутки после иммунизации вызывает образование специфических антител у 100 свиней. Чувствительность к антибиотикам. Вирус резистентен к действию антибиотиков. Способы и условия хранения. Условия хранения лиофильно высушенный, при температуре не выше 20 С в течение 5 лет. Жизнеспособность его поддерживается путем пассирования на культуре клеток -145. Условия консервации. Лиофильная сушка в защитной среде или при температуре не выше 20 С. Таким образом, поставленная задача достигается за счет того, что предлагаемый нами штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней КМИЭВ-112 имеет более высокую биологическую и антигенную активность по сравнению с прототипом. Так, инфекционный титр вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней штамма КМИЭВ-112 достигает 5,8-6,0 ТЦД 50/см 3, тогда как максимальный титр прототипа составляет 5,5 ТЦД 50/см 3, инокуляция заявляемого штамма вызывает образование антител у 100 свиней, тогда как при введении прототипа животным этот показатель составил 75 . Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами. Пример 1. Выделение штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свинейКМИЭВ-112. Вирус РРСС штамма КМИЭВ-112 успешно репродуцируется в легочных альвеолярных макрофагах (АМФ) поросят. Для получения АМФ использовали 4-6-недельных поросят, свободных от патогенной микрофлоры ферм. АМФ выделяли двухкратным промыванием отпрепарированных и изолированных легких забуференным физраствором, содержащим антибиотики (пенициллин, стрептомицин, неомицин и амфотерицин), который нагнетали через трахею с помощью автоматического шприца с иглой (около 500 мл). Выбор жидкости из легких, содержащей АМФ, проводят обычно шприцами через то же отверстие. Суспензию клеток из легких центрифугировали при 1500 оборотах 15 мин. При наличии эритроцитов к осадку добавляли 0,83 -ный раствор хлорида аммония и после 5 минутной инкубации при комнатной температуре клетки вновь центрифугировали при тех же условиях. Заражение вирусом РРСС проводили через 2-24 ч после двухкратной отмывки питательной средой и антибиотиками. Учет цитопатического действия вируса проводили через 24, 48, 72, 96 и 120 ч. Пример 2. Селекционирование и культивирование штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свинейКМИЭВ-112. Вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней штамма КМИЭВ-112 культивировали на перевиваемой культуре клеток -145 (клон МА-104 - почка макакирезус). Для культивирования вируса использовали 48-72-часовой монослой культуры, выращенный в клинских матрасах в стационарных условиях. Перед заражением культуры клеток из флаконов удаляли ростовую среду, монослой отмывали фосфатно-солевым бу 3 18555 1 2014.08.30 фером от продуктов жизнедеятельности клеток. Затем культуру клеток заражали вирусом РРСС в дозе 0,01-0,1 ТЦД 50 на клетку и помещали на контакт в термостат при температуре(370,5) С на 1 ч. После контакта в матрасы вносили поддерживающую питательную среду Игла, обогащенную глутамином в концентрации 0,3 мг/мл и 2 -ной фетальной сывороткой. Ежедневно за зараженной культурой клеток вели наблюдение в течение 3-7 суток(световая микроскопия). Матрасы с ярко выраженными цитопатическими изменениями монослоя для хранения и дальнейшего использования замораживали при температуре 20 С. Цитопатическое действие (ЦПД) вируса РРСС на культуру клеток -145 проявлялось в следующем клетка округлялась, то есть теряла поверхностные выступы (филлоподии и псевдоподии), образовывались шарообразные скопления над поверхностью монослоя и в конечной стадии наблюдали полный ее коллапс. Пример 3. Определение титра вируса репродуктивно-респираторного синдрома свинейштамма КМИЭВ-112. Определение титра инфекционности вируса РРСС штамма КМИЭВ-112 производили путем титрования на перевиваемой культуре клеток -145. Сущность титрования основана на цитопатическом действии вируса, то есть способности вируса вызывать деструкцию клеток монослоя. Для титрования вируса РРСС использовали 2-3-суточный монослой культуры клеток-145, выращенный в пробирках или пенициллиновых флаконах. Вначале готовили десятикратные разведения (от 10-1 до 10-9) вируссодержащего материала на среде Игла без сыворотки ( 7,0-7,4). Каждое разведение вируса готовили отдельной стерильной пипеткой. Предварительно из пробирок сливали ростовую среду, вносили по 0,1 см 3 разведенного вируса. Каждое разведение вируса вносили в 4 пробирки с культурой клеток. После 1 ч контакта добавляли 0,9 см 3 питательной среды. На пробирках указывали номер исследуемого материала (числитель) и разведения (знаменатель). Пробирки складывали в специальные кюветы или оставляли в штативах и в наклонном положении помещали в термостат для инкубирования при температуре 37 С. Одновременно ставили контроль с незараженной культурой клеток. На вторые сутки проводили первый учет результатов титрования вируса. Каждую пробирку просматривали под малым увеличением микроскопа и отмечали ЦПД вируса (условно в крестах). Окончательный учет результатов проводили через 144 ч после заражения культуры клеток. Результаты титрования считали достоверными при сохранении монослоя в контроле. Титр вируса вычисляли по методу Кербера в модификации Ашмарина и выражали вТЦД 50/см 3. Биологическая активность штаммаКМИЭВ-112 составляла 5,8-6,0 ТЦД 50/см 3. Пример 4. Определение иммуногенной активности штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свинейКМИЭВ-112. Иммуногенную активность вируса РРСС штамма КМИЭВ-112 проверяли на 6 поросятах 21-28-дневного возраста, не имеющих в сыворотке крови антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Четырем поросятам вводили внутримышечно вирус в объеме 2 см 3 (доза вируса составляла 4,0 ТЦД 50 вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней), два поросенка служили контролем, им вводили внутримышечно физиологический раствор. Через 21 сутки после иммунизации у всех животных отбирали кровь с целью получения сыворотки для определения наличия антител к вирусу РРСС методом твердофазного иммуносорбентного ферментного анализа. Для определения наличия в сыворотках крови антител к вирусу РРСС использовали набор 2.0 производства(Корея). Пробу сыворотки крови оценивали как положительную, если соотношение / (отношение проба/положительный контроль) больше или равно 0,4. Пробу сыворотки крови оценивали как отрицательную, если соотношение / меньше 0,4. 4 18555 1 2014.08.30 Результаты изучения иммуногенной активности штамма вируса репродуктивнореспираторного синдрома свинейКМИЭВ-112 представлены в таблице. Результаты изучения иммуногенной активности штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свинейКМИЭВ-112 Уровень антител в ИФА, / Штамм вируса Поросенок фон 14-е сутки 21-е сутки 1 0 1,9 2,1 штамма 2 0 2,6 3,13 0 3,9 5,3 4 0 2,5 3,70 0 0 КМИЭВ-112 5 (контроль) 6 (контроль) 0 0 0 Как видно из таблицы, введение штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свинейКМИЭВ-112 экспериментальным поросятам приводило к образованию антител в сыворотках крови на 21-е сутки (показатель / составлял 2,1-5,3) в 100 случаях. Таким образом, штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свинейКМИЭВ-112 обладает по сравнению с прототипом более высоким титром 5,8-6,0 ТЦД 50/см 3 (у прототипа - 5,5 ТЦД 50/см 3) и, как следствие, высокой иммуногенностью, в 100 случаев происходит образование антител (у прототипа - в 75 случаев), и может быть использован для изготовления вакцины в качестве штамма-антигена. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5