Способ определения активности бактериальной холестериноксидазы

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗЫ(71) Заявители Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Фалетров Ярослав Вячеславович Казакевич Юлия Константиновна Рудая Елена Викентьевна Фролова Нина Степановна Костин Дмитрий Георгиевич Белевич Екатерина Иосифовна Слобожанина Екатерина Ивановна Шкуматов Владимир Макарович(73) Патентообладатели Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ определения активности бактериальной холестериноксидазы, отличающийся тем, что готовят опытный и контрольный образцы, при этом смешивают соответственно исследуемую культуральную жидкость бактерий или раствор, содержащий холестериноксидазу с известной активностью, с буферным раствором 7,0-7,5, содержащим 5-10 мкМ субстрата холестериноксидазы, представляющего собой 25(7-нитробенз-2-1,3-оксадиазол-4-ил)метиламино-27-норхолестерин или 22-(-(7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4 ил)амино)-23,24-биснор-5-холен-3 бета-ол, 0,05-0,25 детергента и 0,05-0,1 мМ дитиотреитола или дитиоэритрола, образцы инкубируют 10-20 мин при 25-37 С, затем экстрагируют непрореагировавший субстрат и продукт реакции из образцов этилацетатом или хлороформом, разделяют их методом ТСХ или ВЭЖХ, регистрируют при длинах волн возбуждения 4705 нм и эмиссии 53010 нм интенсивность флуоресценции продукта реакциии субстрата реакциив опытном образце, а также интенсивность флуоресцен ции продукта реакциии субстрата реакциив контрольном образце, рассчитывают степень превращения субстрата холестериноксидазы в продукт реакции в опытном образцепо формуле и определяют активность бактериальной холестериноксидазы А в ЕД по формуле Настоящее изобретение относится к биохимии, микробиологии, энзимологии, а именно к способам определения активности холестериноксидаз - ферментов бактерий, катализирующих окисление 3 бета-гидроксигруппы холестерина (холест-5-ен-3 бета-ола) до 3 кетогруппы. Изобретение может быть использовано для определения активности холестериноксидаз в растворах биологических образцов. Известны косвенные и прямые способы определения активности холестериноксидаз. Косвенные способы основаны на том, что в процессе окисления 5 ен-3 бета-гидроксистероидов холестериноксидазами кислород восстанавливается до перекиси водорода 1,2, которая далее вовлекается в катализируемые пероксидазами реакции превращения хромо- или флуорогенных соединений в соответствующие продукты, определяемые спектрофото- или спектрофлуорметрически 3. Недостатками этих способов являются необходимость проведения холостых опытов, необходимость дополнительного использования пероксидаз, возможность занижения результатов вследствие конкурентных ферментативных (каталаза) или неспецифических (ионы 2, 2, 2) превращений перекиси водорода в биологических образцах. Прямые способы определения активности холестериноксидаз основаны на определении холест-4-ен-3-она - продукта окисления холестерина холестериноксидазами. Для его определения образец экстрагируют органическими растворителями и проводят анализ экстракта на холест-4-ен-3-он при помощи газовой, высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) или тонкослойной (ТСХ) хроматографии, а также напрямую спектрофотомерически по поглощению при 240 нм в матрице образца или при селективной экстракции стероидов алифатическими углеводородами 4, 5. Недостатками данных способов являются завышение результата при совместной экстракции веществ,поглощающих при 24020 нм, относительно небольшая чувствительность. Использование радиоактивно-меченых холестеринов (1,2-ди-3-, 7-3- или 4-13-холестерина и т.п.) позволяет селективно и высокочувствительно определять превращение холестерина в холест-4-ен-3-он после их хроматографического разделения при использовании сцинтилляционных счетчиков или радиоавтографии пластинок ТСХ. В качестве прототипа принят способ, в котором в буферном растворе, содержащем холестериноксидазу, осуществляют ферментативное превращение радиоактивно-меченого холестерина, экстракцию радиоактивных стероидных субстрата и продукта, хроматографическое разделение субстрата и продукта методом ТСХ, детектирование образования продукта путем химической визуализации соответствующих зон пластинки, и оценка количеств субстрата и продукта с помощью сцинтилляционного счетчика 6. Недостатками данного способа являются необходимость специальной организации лабораторного помещения, хранения, сбора и утилизации радиоактивных веществ, подготовки персонала для работы с ними, повышенная вредность работы с радиоактивными веществами, необходимость дополнительной стадии химической обработки пластинки ТСХ для визуализации хроматографических зон стероидов, а также наличие радиоактивных примесей в коммерческом 7-3-холестерине 7. Задачей изобретения является создание прямого способа определения активности холестериноксидазы, характеризующегося сопоставимой чувствительностью с прототипом,но более безопасного и экспрессного. 2 17680 1 2013.10.30 Решение данной задачи достигается тем, что в заявляемом способе готовят опытный и контрольный образцы, при этом смешивают соответственно исследуемую культуральную жидкость бактерий или раствор, содержащий холестериноксидазу с известной активностью, с буферным раствором 7,0-7,5, содержащим 5-10 мкМ стероидного субстрата,представляющего собой 25-(7-нитробенз-2-1,3-оксадиазол-4-ил)метиламино-27-норхолестерин(25 холестерин) или 22-(-(7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил)амино 23,24-биснор-5-холен-3 бета-ол (22 холестерин), 0,05-0,25 детергента и 0,05-0,10 мМ дитиотреитола или дитиоэритрола, образцы инкубируют 10-20 мин при 25-37 С, затем экстрагируют непрореагировавший субстрат и продукт реакции из образцов этилацетатом или хлороформом, разделяют их методом ТСХ или ВЭЖХ, регистрируют при длинах волн возбуждения 4705 нм и эмиссии 53010 нм интенсивность флуоресценции продукта реакциии субстрата реакциив опытном образце, а также интенсивность флуоресценции продукта реакции 7 и субстрата реакциив контрольном образце, рассчитывают степень превращения субстрата холестериноксидазы в продукт реакции в опытном образцепо формуле,и определяют активность бактериальной холестериноксидазы А в ЕД по формуле, где- активность холестериноксидазы в контрольном образце, ЕД. Флуоресцентные свойства 22 холестерина, 25 холестерина и соответствующих продуктов их окисления холестериноксидазами позволяют селективно и чувствительно(предел обнаружения не более 0,2 пмоль) обнаруживать данные соединения, что сопоставимо с параметрами методов с использованием радиоактивно-меченого холестерина. Способ осуществляется следующим образом. Готовят по 0,8-1,2 мл опытного и контрольного образцов, смешивая соответственно исследуемую культуральную жидкость бактерий или раствор, содержащий холестериноксидазу с известной активностью, с буферным раствором 7,0-7,5, содержащим 5-10 мкМ стероидного субстрата (25-холестерина или 22 холестерина), 0,05-0,25 детергента и 0,05-0,10 мМ дитиотреитола или дитиоэритрола соответственно. Далее образцы инкубируют 10-20 мин при 25-37 С,затем экстрагируют непрореагировавший субстрат и образовавшийся продукт реакции из данных образцов 1-4 мл этилацетата или хлороформа, разделяют их методом ТСХ или ВЭЖХ. Для ТСХ используют не менее 20 мкл экстракта, силикагелевые пластинки, ультрафиолетовые лампы с максимумом излучения 365 нм для чувствительной визуализации хроматографических зон (пятен). Наличие субстрата и продукта определяют по их хроматографической подвижности , учитывая, что продукт в таких условиях обладает большей подвижностью. Для количественного определения степени превращения субстрата в продукт соответствующие зоны пластинки вырезают, экстрагируют равным объемом этанола или другого органического растворителя. Далее с использованием спектрофлуориметра регистрируют при длинах волн возбуждения 4705 нм и эмиссии 53 0 10 нм интенсивность флуоресценции продукта реакции р и субстрата реакциив опытном образце, а также интенсивность флуоресценции продукта реакциии субстрата реакциив контрольном образце. Для ВЭЖХ используют прибор со спектрофлуориметрическим детектором, регистрирующим интенсивность флуоресценции при длинах волн 3 17680 1 2013.10.30 возбуждения и регистрации 4705 нм и 53010 нм соответственно, колонку с неполярной неподвижной фазой, 2-10 мкл экстракта. Наличие субстрата и продукта определяют по их временам удерживания. Величиныипринимают равными площадям под хроматографическими пиками продукта и субстрата в случае анализа опытного образца, а величиныи субстрата реакции- в случае анализа контрольного образца. Далее рассчитывают степень превращения субстрата холестериноксидазы в продукт реакции в опытном образце по формуле,и определяют активность бактериальной холестериноксидазы А в ЕД по формуле, где- активность холестериноксидазы в контрольном образце, ЕД. Пример 1. Готовят опытный и контрольный образцы, при этом смешивают соответственно по 0,02 мл культуральной жидкости бактерии 21387 (опыт) или раствора, содержащего 0,04 ЕД коммерческой холестериноксидазы В.(контроль), с 1 мл предварительно термостатированного при 30 С раствора 22-холестерина с концентрацией 10 мкМ в 20 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,2), дополнительно содержащего 0,05 холата натрия, 0,1 Твин 80 и 0,05 мМ дитиоэритрола. Полученные смеси выдерживают в течение 20 мин при 30 С и далее экстрагируют 2 мл этилацетата. По 20 мкл экстрактов наносят на силикагелевую пластинку для ТСХ длиной 10 см на расстоянии 1 см от нижнего края пластинки. Далее проводят разделение субстрата и продукта с использованием смеси бензолацетон (41). Коэффициенты подвижностисубстрата и продукта в данных условиях составляют 0,360,02 и 0,470,02 соответственно. Наличие холестериноксидазы в образцах подтверждается детектированием пятен продукта. Величины интенсивности флуоресценции продуктаи субстратав опыте составили 1,06 и 0,23 отн. ед., а величиныи субстрата реакциив контроле - 1,00 и 0,21 соответственно. Степени превращенияисоста 0,23 0,21 вили 0,178 и 0,174 . Активность холестериноксидазы в аликвоте 0,231,06 0,211,00 0,178 культуральной жидкости 0,040,041 (ЕД ) . Время анализа не превышает 50 мин 0,174 с возможностью параллельного исследования нескольких образцов. Пример 2. Аналогично примеру 1, только с использованием анализа ВЭЖХ с детектированием по флуоресценции при длинах волн возбуждения и регистрации 4705 нм и 53010 нм соответственно, хроматографической колонки 2504 мм с октадецил-силикагелем в качестве неподвижной фазы, смеси ацетонитрилводаизопропанол (84164 по объему) в качестве элюента. Времена удерживания субстрата и продукта составили 7,1 и 6,4 мин соответственно. Величиныив опыте составили 1063,873 и 231,676 тыс. отн. ед., аив контроле - 1062,903 и 231,005 тыс. отн. ед. соответственно. Соотношенияисоставили 0,179 и 0,179, соответственно, а активность холестериноксидазы в аликвоте культуральной жидкости А составила 0,040 ЕД. Время анализа не превышает 40 мин. 17680 1 2013.10.30 Пример 3. Аналогично примеру 1, только с использованием 1 мл 5 мкМ раствора 25-холестерина, 0,05 М Трис- буфер ( 7,5), содержащего 0,25 Тритон-Х 100, 0,1 мМ дитиоэритрола и 20 ЕД/мл каталазы, к которому добавляли 0,04 мл раствора, содержащего 0,004 ЕД нативной холестериноксидазы бактерии. (контроль) или 0,04 мл данного раствора, в котором фермент был предварительно инактивирован нагреванием до 100 С в течение 10 мин (опыт). Смесь выдерживают в течение 10 мин при 37 С и далее экстрагируют 1 мл хлороформа. Величиныив контроле составили 2,45 и 0,25 отн.ед.,аидля инактивированного образца - 2,71 и 0,01 отн.ед. соответственно. Соотношенияисоставили 0,093 и 0,003, соответственно. Рассчитанная активность инактивированного образца 0,001. Время анализа не превышает 30 мин. Таким образом, заявляемый способ позволяет достоверно и экспрессно определять холестериноксидазы непосредственно по превращению стероидных субстратов в условиях неспециализированной лаборатории без использования потенциально опасного радиоактивно-меченого холестерина и без привлечения специально обученного персонала. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.