Способ определения активности тиаминмонофосфатазы

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТИАМИНМОНОФОСФАТАЗЫ(71) Заявитель Государственное учреждение Научно-производственный центр Институт фармакологии и биохимии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Макарчиков Александр Федорович Русина Ирина Михайловна Шляхтун Алексей Генрихович Лучко Татьяна Александровна Макар Елена Антоновна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Научно-производственный центр Институт фармакологии и биохимии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ определения активности тиаминмонофосфатазы путем определения скорости тиаминмонофосфатазной реакции, отличающийся тем, что после остановки тиаминмонофосфатазной реакции осуществляют дериватизацию образовавшихся тиаминмонофосфата и тиамина, определяют количество полученных тиохроммонофосфата и тиохрома с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в 50 мМ -фосфатном буфере с 8,0, содержащем 2,5 тетрагидрофурана, на колонке-18 3100 мм с протекторным картриджем 4,612,5 мм при температуре 25 С и скорости потока 1 млмин-1 и рассчитывают скорость тиаминмонофосфатазной реакции. Изобретение относится к разработке способов определения активности ферментов и может быть использовано для определения содержания и исследования кинетических свойств тиаминмонофосфатазы (ТМФаза) в биологических объектах. Тиаминмонофосфат (ТМФ) обнаружен в различных объектах живой природы. В процессе метаболизма в тканях млекопитающих ТМФ подвергается дефосфорилированию мембранно-связанными фосфатазами в соответствии с реакцией ТМФтиаминнеорганический фосфат . Известны способы регистрации ТМФазной активности по количеству продукта реакции -(, //. . , 1960 43, 335-336 , //.. ., 1982 378, 188-214.//. ., 1988 51, 730-735). 14592 1 2011.08.30 Недостатком данных способов является низкий предел обнаружения(10-20 нмоль),вследствие чего они непригодны для измерений активности ТМФазы при концентрациях субстрата менее 50 мкМ. Задача заявляемого изобретения состоит в разработке способа определения ТМФазной активности, позволяющего проводить измерения ферментативной активности при концентрациях субстрата, близких к физиологическим (порядка 5-10 мкМ). Указанная задача решается за счет применения высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для разделения и оценки содержания в реакционной смеси субстрата ТМФ - и второго продукта реакции - тиамина. Способ осуществляют следующим образом 1) составляют смесь для проведения ТМФазной реакции, внося в пробирку 0,05 мл буферного раствора, 0,05 мл 50 мМ 2, раствор ТМФ и дистиллированную 2 до общего объема 0,49 мл. Смесь прогревают в термостате при 37 С в течение 3 мин. Реакцию начинают, добавляя 0,01 мл исследуемого образца (гомогенат ткани), и проводят 60120 мин при 37 С. Контрольную пробу готовят аналогичным образом, за исключением того, что исследуемый образец вносят в реакционную смесь непосредственно перед остановкой реакции 2) реакцию останавливают, внося в пробирку 0,05 мл 55 -ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Осадок удаляют центрифугированием 3) в чистую пробирку отбирают 0,2 мл надосадочной жидкости и экстрагируют ТХУ диэтиловым эфиром (0,6 мл). Экстракцию повторяют 3 раза 4) проводят дериватизацию, добавляя к 0,05 мл обработанной диэтиловым эфиром пробы 0,031 мл окислителя (4,3 мМ 36 в 12,5 растворе ) и встряхивая смесь 30 сек 5) разделяют образовавшиеся тиохроммонофосфат (ТхМФ) и тиохром методом ВЭЖХ, рассчитывают относительные площади пиков (в ) и выражают активность ТМФазы в выбранных единицах (мкМмин-1). Изобретение иллюстрируется примерами. Пример 1 Разделение стандартной смеси ТМФ и тиамина методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией. Разделение осуществляют в хроматографе 1200 с флуоресцентным детектором на колонке-18 3100 мм с протекторным картриджем 4,612,5 мм при температуре 25 С и скорости потока 1 млмин-1. Мобильная фаза 50 мМ -фосфатный буфер,8,0, содержащий 2,5 тетрагидрофурана. Настройки детектора длина волны возбуждения - 365 нм, эмиссии - 465 нм. Продолжительность разделения 5 мин. Перед инжекцией в хроматограф пробы окисляют с целью превращения ТМФ и тиамина соответственно в ТхМФ и тиохром (дериватизация). Для этого к 0,05 мл стандартной смеси добавляют 0,031 мл раствора, содержащего 4,3 мМ 36 в 12,5, и встряхивают в течение 30 сек. Затем раствор разбавляют 0,05 фосфатным буфером с 7,2 (0,9 мл) и нейтрализуют до 8,0, добавляя 0,035 мл 1. Степень нейтрализации контролируют с помощью индикаторной бумажки. При разделении в указанных условиях среднее время удерживания ТхМФ составляет 0,95 мин, тиохрома - 3,82 мин (фиг. 1). Как следует из таблицы, стандартное отклонение, являющееся критерием воспроизводимости, при определении ТМФ составляет 6,461, при определении тиамина -1,058. Точность метода, характеризуемая процентным отношением ошибки к среднему значению определяемой величины, равна 1,91 для ТМФ и 0,37- для тиамина. Данная хроматографическая система позволяет регистрировать 50 фмоль ТхМФ и тиохрома в вводимой в хроматограф пробе, что соответствует концентрациям ТМФ и тиамина в исходном растворе 50 нМ. 14592 1 2011.08.30 Таблица Определение Площадь пика,ТхМФ Тиохром Ошибка Среднее Стандартное среднего значение отклонение 3 значения 201,4 195,2 6,461 3,730 164,9 164,5 1,058 0,611 Пример 2 Определение -оптимума ТМФазной активности в гомогенате печени крысы. Гомогенат готовили, измельчая навеску печени в стеклянном гомогенизаторе в 4-х объемах 50 мМ трис- буфера с 7,3, содержащего 0,15 и 0,2 мМ ЭДТА. Реакционная смесь для определения ТМФазной активности состояла из 50 мМ буферного раствора, 5 мМ 2, 100 мкМ ТМФ и 0,01 мл аликвоты гомогената в объеме 0,5 мл. Реакцию осуществляли в течение 57 мин при 37 С и останавливали добавлением 0,05 мл 55 -ной ТХУ. Осадок удаляли центрифугированием, отбирали 0,2 мл надосадочной жидкости и экстрагировали ТХУ диэтиловым эфиром (0,6 мл), повторяя экстракцию 3 раза. В контрольные пробы гомогенат вносили непосредственно перед остановкой реакции. Дериватизацию и разделение субстрата и продукта реакции проводили, как описано в примере 1. Расчет скорости реакции проводят следующим образом. Дано условия проведения реакции - 50 мМ трис- буфер с 9,0, 5 мМ 2, 100 мкМ ТМФ время проведения реакции - 57 мин. Результаты измерений площадь пика ТхМФ в контрольной пробе -340,2,площадь пика тиохрома в контрольной пробе - 21,0 площадь пика ТхМФ в опытной пробе -348,6 площадь пика тиохрома в опытной пробе - 226,7 Вычисления 1) находят долю тиохрома в контрольной пробе 2/(21(1,0/(1,0340,2)0,003 2) находят долю тиохрома в опытной пробе 2/(21(26,7/(26,7348,6)0,071 3) находят разность долей тиохрома в опытной и контрольной пробах 0,0710,0030,068 4) находят концентрацию образовавшегося в реакции тиамина, умножая разность долей тиохрома на исходную концентрацию ТМФ в реакционной смеси 0,0681006,8 мкМ 5) находят скорость реакции (активность) путем деления концентрации образовавшегося в реакции тиамина на время реакции 6,8/570,120 мкМмин-1. Зависимость ТМФазной активности гомогената печени крысы отизображена на фиг. 2. Пример 3 Определение константы Михаэлиса (м) фермента гидролиза ТМФ в гомогенате печени крысы при 9,0. Гомогенат получали, как описано в примере 2. Для измерений начальной скорости ТМФазной реакции готовили серию пробирок с реакционной смесью объемом 0,5 мл, содержащей 50 мМ трис- буфер с 9,0, 5 мМ 2 и возрастающие от 7 до 1300 мкМ концентрации ТМФ. Реакцию начинали добавлением 0,01 мл гомогената и проводили в течение 120 мин. Реакцию останавливали, внося по 0,05 мл 55 -ной ТХУ. Осадок удаляли центрифугированием, отбирали 0,2 мл надосадочной жидкости и экстрагировали ТХУ диэтиловым эфиром (0,6 мл), повторяя экстракцию 3 раза. В контрольные пробы гомогенат вносили непосредственно перед остановкой реакции. Дериватизацию и разделение субстрата и продукта реакции проводили, как описано в примере 1. Результа 3 14592 1 2011.08.30 ты представлены в координатах Хейнса на фиг. 3, из которой видно, что при 9,0 значение м ТМФазы гомогената печени крысы составляет 473 мкМ. Таким образом, предложенный способ отличается высокой чувствительностью ( 50 фмоль ТхМФ и тиохрома в пробе), точностью (1,91 при определении ТМФ и 0,37 при определении тиамина) и позволяет проводить измерения ТМФазной активности в биологических образцах при концентрациях субстрата ниже 50 мкМ. Предложенный способ может использоваться в медико-биологических исследованиях для определения ТМФазной активности, идентификации и изучения свойств ферментов,осуществляющих гидролиз ТМФ в биологических объектах. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4