Способ определения активности пантотенаткиназы

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПАНТОТЕНАТКИНАЗЫ(71) Заявитель Государственное учреждение Научно-производственный центр Институт фармакологии и биохимии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Мойсеенок Андрей Георгиевич Гуринович Валерий Александрович Петухова Тамара Паатовна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Научно-производственный центр Институт фармакологии и биохимии Национальной академии наук Беларуси(56) ГУРИНОВИЧ В.А. Биотрансформация и протеидизация производных пантотеновой кислоты в печени животных Автореф. дис. - Гродно, 2003. - С. 5-9. МОЙСЕЕНОК А.Г. Биосинтез кофермента А в метаболической активности производных пантотеновой кислоты Автореф. дис. - М., 1996. - С. 9-10.2003/008626 2.62166896 А, 1987.(57) Способ определения активности пантотенаткиназы, включающий проведение фосфорилирования пантотенаткиназой 14 С-меченого пантотената натрия в инкубационной смеси с 6,5, содержащей 0,05 М трис-малеатный буфер, 5 мкмоль АТФ, 5 мкмоль 2, выделение 4-фосфо-пантотеновой кислоты из смеси и определение активности пантотенаткиназы по количеству 14 С-меченой 4-фосфо-пантотеновой кислоты, отличающийся тем,что выделение 14 С-меченой 4-фосфо-пантотеновой кислоты осуществляют путем обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии на аналитической колонке 4250 мм, заполненной бондапаком 18, в течение 6 мин. Изобретение относится к области экспериментальной медицины и биохимии и может использоваться для определения активности пантотенаткиназы. Пантотенаткиназа (АТФД-пантотенат-4-фосфотрансфераза, КФ 2.7.1.33) является ключевым ферментом цепи реакций, приводящих к образованию кофермента А из пантотеновой кислоты и других предшественников, и основным механизмом регуляции биосинтеза кофермента А - важнейшего кофактора метаболических путей высших и низших организмов. В последние годы появилось значительное число работ, обусловленное открытием генетического дефекта пантотенаткиназы при нейродегенеративном синдроме.-// . . . . - 2002. - . 6.5. - . 243-247, а также разработана технология патогенетической терапии на основе нуклеиновой кислоты, кодирующей синтез белка пантотенаткиназы патент 03008626. Значение данного направления исследований и углубленное изучение пантоте 11205 1 2008.10.30 наткиназо-ассоциированной нейродегенерации объясняется этиопатогенетической близостью синдрома таким широко распространенным нейродегенеративным заболеваниям, как болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона, боковой амиотрофический синдром,рассеянный склероз. В 2005 г. исследование пантотенаткиназы предложено как биомаркер на развитие стафилококковой инфекции патент 2387600. Основным препятствием развития этих исследований является отсутствие доступного метода изучения активности пантотенаткиназы, позволяющего осуществлять лабораторный анализкак при моделировании нейродегенеративной патологии, так и при исследовании клеток крови человека с диагностическими и прогностическими целями. Известен метод определения активности пантотенаткиназы, основанный на анализе убыли субстрата реакции - пантотеновой кислоты - с использованием микробиологического метода исследования витамина специфической тест-культурой...//.- 1967. - . 61. -3. - . 290-298. Основным недостатком метода, ограничивающим его широкое использование, является громоздкость, длительность и трудновоспроизводимость микробиологического анализа, малодоступность тест-микроорганизмов и невозможность применения в диагностических целях. Известны способы определения активности пантотенаткиназы на основе радиометрического подхода с использованием меченого радионуклида пантотеновой кислоты. Такие методы и их модификации успешно применены в изучении свойств пантотенаткиназы,выделенных из различных источников, при клонировании фермента, как с использованием меченого витаминаС.О.,.,.,.// . . . - 2000. . 275. -2. - . 1377-1383, так и с использованием второго субстрата реакции, позволяющего анализировать фосфорилированный продукт ферментативного превращения патент США 6.720.162. Недостатком этих методов является использование устаревшего метода ионообменной хроматографии (ИОХ), требующего значительных затрат времени и не позволяющего осуществлять массовые исследования. Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности пантотенаткиназной реакции по наработке в ферментативной системе 4-фосфо-пантотеновой кислоты, т.е. продукта реакции с использованием ИОХ Хомич Т.И., Воскобоев А.И.,Черникевич И.П., Мойсеенок А.Г. Радиометрический метод определения активности АТР Д-пантотенат-4-фосфотрансферазы // Вопр. мед. химии. - 1984. - Т. 30. -1. - С. 131132. Недостаток способа заключается в длительности, недостаточно высокой специфичности и невозможности использования для массовых исследований. Задача изобретения - сократить время проведения анализа и повысить специфичность способа. Поставленная задача решается путем разделения пробы радиоактивного витамина на субстрат - пантотеновую кислоту и продукт реакции - 4-фосфо-пантотеновую кислоту в результате проведения ферментативной реакции в инкубационной среде, обеспечивающей ее оптимальное течение, при этом отличительным моментом является то, что для выделения 14 С-меченого продукта реакции осуществляют обращенно-фазную высокоэффективную жидкостную хроматографию пробы, используя аналитическую колонку (4250 мм),заполненную бондапаком 18, в течение 6 мин. Способ осуществляют следующим образом. Аликвоту инкубационной среды после депротеинизации (150 мкл) фильтруют через фильтр 0,45 мкм и 50 мкл вводят в хроматограф. Осуществляют обращенно-фазную высокоэффективную жидкостную хроматогра 2 11205 1 2008.10.30 фию (ВЭЖХ) меченой пробы, используя аналитическую колонку (4250 мм), заполненную бондапаком С 18. Время разделения одной пробы на колонке составляет 6 мин. Осуществляют изократное элюирование подвижной фазой, содержащей 50 мМ калийфосфатный буфер,5,0 и метанол в соотношении (91,58,5 /). Фракции собирают по 0,8 мл и определяют в них радиоактивность субстрата и продукта пантотенаткиназной реакции после внесения аликвоты полученного супернатанта во флаконы с диоксановым сцинтиллятором. Целесообразность использования ВЭЖХ в качестве ключевого элемента, позволяющего изолировать продукт пантотенаткиназной реакции в предлагаемом способе, определяется высокой специфичностью метода, скоростью разделения и возможностью массового исследования (до 3-4 проб в час). Таблица 1 Сравнительная характеристика предлагаемого способа и прототипа Общее время 1 ана- Количество проб Характер выделения про- Время вылиза (с подготовкой в одновременСпособ дукта, степень его выхо- деления,колонки и инкубаци- ном исследовада мин ей), час нии Предла- ВЭЖХ, 45 при содергаемый жании белка 3 мг/мл ин 6 2 64 пробы/16 ч способ кубационной среды ИОХ, 29,1 при содерПрототип жании белка 3 мг/мл ин 95 10,5 10 проб/11,5 ч кубационной среды Приводим доказательства возможности осуществления метода. Пример 1. Использование метода ВЭЖХ для определения активности пантотенаткиназы в печени крысы. Пантотенаткиназную реакцию проводили в течение 1 часа при 37 С. Состав инкубационной смеси 0,05 М трис-малеатный буфер ( 6,5), 5 моль АТФ, 2 5 моль,14 С-ПАК 2,510-8 М, пантотенат натрия 610-5 М и источник фермента (цитозоль печени крыс, полученный после центрифугирования гомогената печени 1 час при 10000 ) в общем объеме 1 мл. В контрольную пробу источник фермента добавляли непосредственно перед остановкой реакции. Реакцию останавливали помещением пробирок с инкубационной средой в кипящую водяную баню на 3 мин. Образцы центрифугировали 10 мин при 700 . Содержание 4-фосфопантотената рассчитывали исходя из известной удельной радиоактивности 14 С-пантотената. 150 мкл супернатанта инкубационной среды фильтровали через фильтр 0,45 мкм и 50 мкл вводили в хроматограф. Хроматографирование осуществляли в режиме изократической элюции на хроматографе Ликвохром-2010 с УФ-детектором, насос высокого давления ЛКБ 2150, скорость элюции 0,8 мл/мин. В качестве подвижной фазы применяли 50 мМ калий-фосфатный буфер 5,0 - метанол, (91,58,5) (/). Скорость элюции 0,8 мл/мин. При анализе смеси стандартов пантотеновой кислоты (ПК) и фосфопантотената (ФПК) измеряли абсорбцию при 210 нм. Подсчет радиоактивности субстрата и продукта пантотенаткиназной реакции осуществляли внесением содержимого фракций во флаконы с диоксановым сцинтиллятором с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика -2. Время удерживания для фосфопантотената и пантотената было 4 и 5,5 мин соответственно. На фиг. 1 показана радиохроматограмма депротеинизированного супернатанта инкубационной смеси (1-3 - реакционная смесь, содержащая экстракт печени крысы), отражающая воспроизводимость способа. 3 11205 1 2008.10.30 В табл. 2 представлены результаты определения активности пантотенаткиназы в печени крысы, 1-3 - три параллельных опыта, содержание белка равно 1 мг/мл инкубационной среды. Таблица 2 Активность пантотенаткиназы Удельная активность пантотенаткиназы Опыт(нмоль ФПК мг белка-1 ч-1) 1 9,8 100,15 2 10,3 3 9,9 Пример 2. Использование метода ВЭЖХ для определения зависимости активности пантотенаткиназы из печени крысы от количества белка. Исследовали применение метода ВЭЖХ для выделения продукта реакции в случае внесения в реакционную среду количества белка от 0,5 до 4 мг/мл. Другие компоненты,вносимые в смесь, были аналогичны, как и в примере 1. На фиг. 2 показана радиохроматограмма, отражающая образование продукта пантотенаткиназной реакции (ФПК) в зависимости от концентрации белка в 1 мл инкубационной смеси. В табл. 3 представлены результаты определения активности пантотенаткиназы в печени крысы в зависимости от концентрации белка в 1 мл инкубационной смеси. Таблица 3 Удельная активность Активность Белок, мг/мл инкубаципантотенаткиназы пантотенаткиназы(нмоль ФПКмг белка ч ) 0,5 5,98 11,96 9 1 8,52 8,52 14 2 19,36 9,68 32 3 26,98 8,99 45 4 32,18 8,04 54 Примечание- указана степень фосфорилирования субстрата. Таким образом, приведенные примеры свидетельствуют о специфичности способа, его воспроизводимости и скорости анализа, превышающих аналогичные параметры прототипа. Все это позволяет использовать его для массовых исследований биологического материала с фармакологическими, диагностическими и прогностическими целями. Фиг. 1 ВЭЖХ депротеинизированного супернатанта инкубационной смеси (1-3-реакционная смесь, содержащая экстракт печени крысы). ПАК - пантотеновая кислота, субстрат реакции ФПК - фосфопантотеновая кислота, продукт реакции. 4 Фиг. 2 Радиохроматограмма, отражающая использование субстрата (ПАК) и образование продукта пантотенаткиназной реакции (ФПК) в зависимости от концентрации белка 1 мл инкубационной смеси. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5