Способ получения антигенов сальмонелл, выбранных из Salmonella dublin КМИЭВ-В115, Salmonella typhimurium КМИЭВ-В128 или Salmonella choleraesuis КМИЭВ-В131

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ САЛЬМОНЕЛЛ,ВЫБРАННЫХ ИЗКМИЭВ-В 115,КМИЭВ-В 128 ИЛИКМИЭВ-В 131(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Амосова Любовь Александровна Гусев Анатолий Алексеевич Ломако Юрий Васильевич Опарина Ирина Владимировна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56)2166329 С 2, 2001.12590 , 2006.2162340 1, 2001. МАКСИМОВИЧ В.В. и др. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины. - Витебск, 2004. - Т. 40. Ч. 1. С. 245-246. МЕДВЕДЕВ А.П. и др. Ветеринарная наука - производству // Научные труды. - 2009. - Вып. 40. - Т. 2. - С. 30-36.(57) Способ получения антигенов сальмонелл, выбранных изКМИЭВВ 115,КМИЭВ-В 128 илиКМИЭВ-В 131,заключающийся в том, что клетки сальмонелл культивируют на мясопептонном бульоне Хоттингера, осаждают центрифугированием, ресуспензируют в 0,05-0,2 -ном растворе солянокислого гидроксиламина до получения концентрации 8-10 млрд. клеток в 1 мл, полученную суспензию инкубируют при 30-38 С в течение 24-48 ч, прогревают на водяной бане при 60-65 С в течение 20 мин, охлаждают при 2-4 С в течение 6-8 ч, центрифугируют 18-20 мин при 10000-12000, после чего отбирают содержащий антигены надосадок. Изобретение относится к области бактериологии и может быть использовано в биотехнологии для приготовления моно- и ассоциированных вакцин для профилактики кишечных инфекций животных и эритроцитарных диагностикумов для регистрации противосальмонеллезных агглютининов. В ветеринарной бактериологии и биотехнологии применяют ряд штаммов сальмонелл для производства вакцин и приготовления эритроцитарных диагностикумов, которые различаются по серовариантной принадлежности. В Республике Беларусь от сельскохозяйственных животных наиболее часто выделяют сероварианты сальмонелл 17436 1 2013.08.30 Так, известен способ извлечения антигенов из бактериальных клеток энтеробактерий,разработанный Буавеном. Сущность способа заключается в обработке бактериальных клеток 0,25 раствором трихлоруксусной кислоты 1. Так, известен способ получения антигенов бактерий, заключающийся в том, что микробную массу обрабатывают смесью фенол/вода при температуре 3-5 либо 65 С 2. Преимуществом данных способов является высокая степень очистки получаемого антигенного препарата, недостатком - неполное извлечение антигена из микробной клетки и снижение его иммуногенности в результате повреждения при извлечении. Также известен способ извлечения антигенов бактерий путем триптического растворения клеток. Сущность способа заключается в том, что микробные клетки бактерий кишечной группы обрабатываются 0,025 -ным раствором трипсина в течение 60 ч при 37 С 3. Преимущество данного способа заключается в том, что он обеспечивает высокий выход антигена, однако существенным недостатком является загрязнение препарата продуктами распада микробной клетки, кроме того, обязательная последующая очистка препарата приводит к потере антигенов. Так, известен способ получения антигенов, основанный на воздействии на микробные клетки разницы температур. Сущность способа заключается в многократном резком замораживании и оттаивании бактериальных клеток 4. Преимуществом данного способа является то, что получаемые препараты малотоксичны. Недостаток состоит в том, что антигены малоиммуногенны и содержат много балластных веществ. Так, известен способ получения поверхностных адгезивных антигенов на основе штамма, включающий культивирование бактериальных клеток штамма на мясопептонном бульоне Хоттингера, осаждение клеток посредством центрифугирования при 6000 об/мин в течение 20 мин, ресуспензирование осадка бактериальных клеток в фосфатно-мочевинном буфере до получения суспензии с концентрацией 100 млрд/мл,прогревание суспензии при температуре 60-65 С в течение 20 мин для экстрагирования адгезивных антигенов, центрифугирование полученной суспензии при 10000 об/мин в течение 30 мин 5. Недостатком указанного способа является применение большого количества мочевины, что затруднило бы получение антигенов в промышленных условиях, а также использование высокой концентрации бактериальных клеток (100 млрд/мл), что уменьшает выход получаемых антигенов. Задачей предлагаемого способа является получение высокоиммуногенных, нетоксичных поверхностных антигенов сальмонелл из специфичных для Республики Беларусь штаммов-антигенов для конструирования вакцин против сальмонеллеза и ассоциированных вакцин против кишечных инфекций, а также для приготовления эритроцитарных диагностикумов для контроля напряженности противосальмонеллезного иммунитета. Поставленная задача реализуется тем, что способ получения антигенов сальмонелл,выбранных изКМИЭВ-В 115,КМИЭВ В 128,КМИЭВ В 131, заключается в том, что клетки сальмонелл культивируют на мясопептонном бульоне Хоттингера, осаждают центрифугированием, ресуспензируют в 0,05-0,2 -ном растворе солянокислого гидроксиламина до получения концентрации 8-10 млрд. клеток в 1 мл, полученную суспензию инкубируют при 30-38 С в течение 24-48 ч, прогревают на водяной бане при 60-65 С в течение 20 мин, охлаждают при 2-4 С в течение 6-8 ч, центрифугируют 18-20 мин при 10000-12000, после чего отбирают содержащий антигены надосадок. Поставленная задача достигается за счет того, что предлагаемый способ использования солянокислого гидроксиламина является щадящим, так как при обработке клетки ча 2 17436 1 2013.08.30 стично сохраняют свою структуру, поэтому продукты их распада не загрязняют получаемый препарат. Прогревание при 60-65 С и последующее охлаждение обеспечивает больший выход веществ полисахаридной природы, отвечающих за специфичность-антигенов. Дальнейшее центрифугирование и использование в качестве источника антигенов деканта, т.е. надосадка, позволяет освободиться от остатков микробных клеток,что снижает реактогенность антигенов. Пример 1. Получение антигенов сальмонелл, выбранных изКМИЭВ-В 115,КМИЭВ-В 128,КМИЭВ-В 131. Бактериальные клетки каждого штамма-антигена сальмонелл культивируют на мясопептонном бульоне Хоттингера, после культивирования центрифугируют полученные культуры штаммов при 6000 об/мин в течение 20 мин для отделения бактериальных клеток от питательной среды. Осадок бактериальных клеток ресуспензируют (разбавляют) 0,05-0,2 -ным раствором солянокислого гидроксиламина до получения суспензии клеток с концентрацией 8-10 млрд/мл. Экстракцию поверхностных антигенов осуществляют за счет инкубирования полученной суспензии 24-48 ч при 30-38 С в термостате, после чего подвергают термической обработке 20 мин при 60-65 С на водяной бане и охлаждают при 2-4 С в течение 6-8 ч. Для осаждения бактериальных клеток суспензию центрифугируют 18-20 мин при 10000-12000, в результате получают осадок бактериальных клеток и надосадок, содержащий поверхностные антигены. Пример 2. Определение безвредности антигенов сальмонелл, выбранных изКМИЭВ-В 115,КМИЭВ-В 128,КМИЭВ-В 131. Полученный образец поверхностных антигенов инъецируют 5-10 белым мышам массой 14-16 г внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. За животными ведут наблюдение в течение 10 дней, учитывая их клиническое состояние. Животные должны оставаться клинически здоровыми. Пример 3. Определение иммуногенности и антигенной активности антигенов сальмонелл, выбранных изКМИЭВ-В 115,КМИЭВВ 128,КМИЭВ-В 131. Образец каждого поверхностного антигена сальмонелл однократно инъецируют белым мышам массой 14-16 г подкожно в дозе 0,4-0,44 мг/мл белка или 5,6-6,0 мкг/мл полисахаридов. На 12-й день по 5 голов из группы декапитируют для получения сыворотки крови и определения титра антител в реакции агглютинации. Остальных животных, разделенных на группы, заражают 4 ЛД 50 ( ,и) гомологичных штаммов, ведут наблюдение в течение 10 дней. Антигенную активность оценивали по титру специфических антител в реакции агглютинации, иммуногенность - согласно выживаемости белых мышей после заражения соответствующими штаммами (таблица). Антигенная активность и иммуногенность антигенов сальмонелл, выбранных изКМИЭВ-В 115,КМИЭВ-В 128,КМИЭВ-В 131 Антиген Полученные протективные антигены сальмонелл обладают антигенной активностью и иммуногенностью. 17436 1 2013.08.30 Источники информации 1. Петросян Е.А. Комплексные антигены тифо-паратифозной группы бактерий. - М. Медгиз, 1961. - С. 10-12. 2. Петросян Е.А. Комплексные антигены тифо-паратифозной группы бактерий. -М. Медгиз, 1961. - С. 17-19. 3. Петросян Е.А. Комплексные антигены тифо-паратифозной группы бактерий. - М. Медгиз, 1961. - С. 25-26. 4. Петросян Е.А. Комплексные антигены тифо-паратифозной группы бактерий. - М. Медгиз, 1961. - С. 32-33. 5. Пирожков М.К. Биологические препараты для специфической профилактики и терапии эшерихиоза животных Автореф. дис.докт. вет. наук. ФГУ ВГНКИ. - М., 2002. 26 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4