Способ получения протективных антигенов Escherichia coli, выбранных из Escherichia coli КМИЭВ-98, Escherichia coli КМИЭВ-39А и Escherichia coli КМИЭВ-38

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНЫХ АНТИГЕНОВ, ВЫБРАННЫХ ИЗКМИЭВ-98,КМИЭВ-39 А ИКМИЭВ-38(71) Заявитель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Гусев Анатолий Алексеевич Ломако Юрий Васильевич Опарина Ирина Владимировна Амосова Любовь Александровна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56) БЕДОЕВА З.М. Тест-системы для иммунологического мониторинга и прогнозирования острых кишечных инфекций животных и усовершенствование средств профилактики Автореф. дис - М., 2006. - С. 7-9,16-18, 36-38.10886 1, 2008.10978 1, 2008.2070819 1, 1996. ЗАЙЦЕВ В.В. и др. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины. Т.40, ч.1. - Витебск, 2004. - С. 211-212. ЛОМАКО Ю.В. Специфическая профилактика колибактериоза телят на основе адгезивных антигенов возбудителя Автореф. дис. - Минск, 2003. С. 3-15. МЕДВЕДЕВ А.П. и др. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины. Т.43, ч. 1. - Витебск, 2007. - С. 154-157. ЗАЙЦЕВ В.В. и др. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины. Т.43, ч. 2. - Витебск, 2007. - С. 38-41.(57) Способ получения протективных антигенов, выбранных изКМИЭВ-98,КМИЭВ-39 А иКМИЭВ-38, заключающийся в том, что клеткикультивируют на мясопептонном агаре, ресуспензируют в физиологическом растворе, содержащем 0,1-0,3 солянокислого гидроксиламина, до получения концентрации 20-25 млрд. клеток в 1 мл, полученную суспензию инкубируют в течение 24-48 ч при температуре 25-28 С, прогревают в течение 20-30 мин при 60-65 С, охлаждают при 4 С в течение 4-6 ч, центрифугируют при 5000-10000 в течение 20-30 мин и отбирают надосадок, содержащий протективные антигены. 17435 1 2013.08.30 Изобретение относится к области бактериологии и может быть использовано в биотехнологии для приготовления моно- и ассоциированных вакцин для профилактики колибактериоза, а также для приготовления эритроцитарных диагностикумов для регистрации и прогнозирования эпизоотического процесса. Так, известен способ получения антигенов из бактериальных клеток энтеробактерий,заключающийся в раздельном культивировании штаммов энтеробактерий на синтетической питательной среде (10-12 ч), экстрагировании антигенов штаммов энтеробактерий(0,05 мг на 109 микробных клеток), и термической обработке при 56 в течение 48 ч с дальнейшим центрифугированием и использованием надосадка в качестве антигенов 1. Недостатком указанного способа является использование высокой концентрации бактериальных клеток (48-50 млрд./мл), что уменьшает выход получаемых антигенов. Задачей предлагаемого способа является получение высокоиммуногенных, нетоксичных антигенов кишечной палочки для конструирования вакцин против колибактериоза и ассоциированных желудочно-кишечных инфекций, а также для приготовления эритроцитарных диагностикумов для регистрации и прогнозирования эпизоотического процесса, а также повышение выхода протективных антигенов. Поставленная задача достигается тем, что способ получения протективных антигенов, выбранных изКМИЭВ-98,КМИЭВ-39 А,КМИЭВ-38, заключается в том, что клеткикультивируют на мясопептонном агаре, ресуспензируют в физиологическом растворе, содержащем 0,10,3 солянокислого гидроксиламина, до получения концентрации 20-25 млрд. клеток в 1 мл, полученную суспензию инкубируют в течение 24-48 ч при температуре 25-28 С,прогревают в течение 20-30 мин при 60-65 С, охлаждают при 4 С в течение 4-6 ч, центрифугируют при 5000-10000 в течение 20-30 мин и отбирают надосадок, содержащий протективные антигены. Таким образом, предлагаемый способ использования солянокислого гидроксиламина является щадящим. При обработке солянокислым гидроксиламином, клетки частично сохраняют свою структуру, поэтому продукты их распада не загрязняют получаемый препарат. Прогревание при 60-65 С обеспечивает больший выход веществ полисахаридной природы, отвечающих за специфичность О-антигенов. Последующее центрифугирование и использование в качестве источника антигенов надосадка позволяет освободиться от остатков микробных клеток, что снижает реактогенность препарата. А также использование штаммов, выделенных в Республике Беларусь, позволяет получить протективные антигены с высокими иммуногенными свойствами. В предлагаемом способе в качестве продуцента антигенов используют штаммы бактерийКМИЭВ-98 - штамм-антиген,КМИЭВ-39 А - штаммантиген,КМИЭВ-38 - штамм-антиген. Штамм бактерийКМИЭВ-98 - штамм-антиген обладает следующими свойствами. Таксономическая принадлежность.относится к 5-й группе факультативно-анаэробных грамотрицательных палочек, подгруппе 1 - семейство ,роду , виду. Морфологические признаки. В мазках, приготовленных из бульонных и агаровых культур, при окраске по Грамму имеет вид тонких коротких (0,2-0,72-4 мкм) грамотрицательных палочек. Культуральные признаки. Факультативный анаэроб. Растет в МПБ, в бульоне на основе перевара Хоттингера с интенсивным помутнением среды и образованием на дне пробирки осадка, легко разбивающегося при встряхивании. Культура на плотных питательных средах формирует круглые, блестящие, выпуклые колонии с приподнятым,более оптически плотным центром. На среде Эндо бактерии образуют колонии красного 2 17435 1 2013.08.30 цвета с металлическим блеском, размером от 0,2 до 0,5 см, с более интенсивно окрашенным центром, подвижны. Биохимические признаки. В биохимическом отношении на средах, содержащих углеводы и многоатомные спирты, штамм ферментирует глюкозу, лактозу, манит, сорбит,арабинозу, мальтозу, ксилозу, манозу, дульцит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол, не образует сероводород, не разжижает желатину, не утилизирует цитраты,дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра. Антигенные признаки. Имеет в своем составе адгезивный антиген 41, О-антиген, не типируемый коммерческим набором О-колисывороток, содержит жгутиковый антиген. Патогенность, иммуногенность. ШтаммКМИЭВ-98 - штамм-антиген патогенен. 50 составляет 670 млн. микробных клеток при внутрибрюшинном заражении. Иммуногенность штаммаКМИЭВ-98 составляет 100 , антигенность в 13,80,14 2. Условия хранения. ШтаммКМИЭВ-98 - штамм-антиген хранится при температуре 24 С после лиофильного высушивания в ампулах в течение 2-3 лет, а также в течение 3-6 месяцев на 0,3 ПЖА под слоем стерильного вазелинового масла. Пример 1. Культивирование штаммаКМИЭВ-98 - штамма-антигена в биореакторе. Штамм бактерийКМИЭВ-98 - штамм-антиген выращивают в течение 8-10 ч (не более 12 ч) при температуре 37 С скорости вращения мешалки в начале культивирования - 70, а в конце - 300 об/мин подаче стерильного воздуха в процессе всего периода культивации - 0,1 л/л среды. Через каждый час культивирования отбирают пробы микробной суспензии, определяют уровень накопления бактериальной массы (по оптическим стандартам мутности) и устанавливаютсреды. Понижениев растущей культуре до 7 и ниже регулируют подщелачиванием путем добавления 10 -ного растворадо 7,6-7,8. Через 2, 4, 6 ч от начала засева среду трижды обогащают раствором глюкозы из расчета 0,3 сухого вещества глюкозы на 1 л среды. Заявленный штамм бактерийКМИЭВ-98 - штамм-антиген выделен в животноводческом хозяйстве Республики Беларусь и поэтому является специфичным для крупного рогатого скота в пределах республики, его включение в вакцину против колибактериоза позволяет усилить ее специфичность и повысить эффективность профилактики данного заболевания. Штамм бактерийКМИЭВ-39 А - штамм-антиген обладает следующими свойствами. Морфологические признаки. Неподвижные короткие (0,2-0,72-4 мкм) грамотрицательные палочки. Культуральные признаки. Факультативный анаэроб. Растет в МПБ, в бульоне на основе перевара Хоттингера с интенсивным помутнением среды и образованием на дне пробирки осадка, легко разбивающегося при встряхивании. На плотных питательных средах формирует круглые, блестящие, выпуклые колонии с приподнятым, более оптически плотным центром. На среде Эндо образует колонии красного цвета с металлическим блеском, размером от 0,2 до 0,5, с более интенсивно окрашенным цветом. Биохимические свойства. Ферментирует глюкозу, лактозу, манит, сорбит, арабинозу,мальтозу, ксилозу, манозу, дульцит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол, не образует сероводород, не разжижает желатину, не утилизирует цитраты, дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра. Антигенные свойства. Имеет в своем составе антиген 25, -антигены, не типируемые коммерческим набором -сывороток, -антиген. Патогенность. Патогенен для белых мышей, 50 составляет 840 млн. микробных клеток при внутрибрюшинном заражении. 17435 1 2013.08.30 Условия хранения. Штамм хранится в защитной среде в лиофилизированном состоянии при влажности не более 3 , от - 2 до - 10 С 2. Штамм бактерийКМИЭВ-38 - штамм-антиген обладает следующими свойствами. Морфологические признаки. Короткие (0,2-0,72-4 мкм), слабоподвижные, грамотрицательные палочки, спор и капсул не образуют. Культуральные признаки. Факультативный анаэроб. Растет в МПБ, в бульоне на основе перевара Хоттингера - с интенсивным помутнением среды и образованием на дне пробирки осадка, легко разбивающегося при встряхивании, на плотных питательных средах формирует круглые, блестящие, выпуклые колонии с приподнятым, более оптически плотным центром. На среде Эндо образует колонии красного цвета с металлическим блеском, размером от 0,2 до 0,5 см, с более интенсивно окрашенным центром, на среде Минка колонии растут в - и -формах. При -формах наблюдаются ровные края, колонии выпуклые, с точкой уплотнения в центре. Биохимические свойства. Ферментирует глюкозу, лактозу, манит, сорбит, арабинозу,мальтозу, ксилозу, манозу, дульцит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол, не образует сероводород, не разжижает желатину, не утилизирует цитраты, дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра. Антигенные свойства. Имеет в своем составе антиген К 99, -антигены, не типируемые коммерческим набором -сывороток, -антиген. Патогенность. Патогенен для белых мышей, 50 составляет 840 млн. микробных клеток при внутрибрюшинном заражении. Ростовые свойства. При культивировании в МПБ Хоттингера в течение 24 ч накопление бактериальной массы составляет 47-50 млрд./см 3. Условия хранения. Штамм хранится в защитной среде в лиофилизированном состоянии при влажности не более 3 , от - 2 до - 10 С 3. Для инактивации протективных антигенов кишечной палочки используют формалин. Формалин - 37 -ный раствор формальдегида, широко применяется для инактивации различных видов микроорганизмов. Его инактивирующее действие возможно благодаря высокой реакционной способности в отношении аминокислот и белков, нуклеотидов и нуклеиновых кислот 4. Пример 2. Получение протективных антигенов, выбранных изКМИЭВ-98,КМИЭВ-39 А,КМИЭВ-38. Бактериальные клетки штаммовКМИЭВ-98 - штамма-антигена,КМИЭВ-39 А - штамма-антигена,КМИЭВ-38 - штамма-антигена раздельно культивируют на МПА в течение 24-48 ч при температуре 36-38 С, ресуспензируют бактериальные клетки раствором 0,1-0,3 солянокислого гидроксиламина, приготовленном на физиологическом растворе, до получения концентрации 20-25 млрд./мл, затем из бактериальных клеток экстрагируют поверхностные антигены в течение 24-48 ч при температуре 25-28 С, после подвергают их термической обработке 20-30 мин при 60-65 С и охлаждают при 4 С в течение 4-6 ч, центрифугируют полученную суспензию при 500010000 в течение 20-30 мин, получают осадок и надосадок, и в качестве источника протективных антигенов используют надосадок, инактивируют экстрагированные протективные антигены штаммов 0,4-0,5 формалином при 37-56 С в течение 24-96 ч. Пример 3. Определение безвредности протективных антигенов, выбранных изКМИЭВ-98,КМИЭВ-39 А,КМИЭВ-38. Полученный образец инъецируют 5-10 белым мышам массой 14-16 г внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. За животными ведут наблюдение в течение 10 дней, учитывая их клиническое состояние. 4 17435 1 2013.08.30 Пример 4. Определение иммуногенной и антигенной активности полученных протективных антигенов, выбранных изКМИЭВ-98,КМИЭВ-39 А,КМИЭВ-38. Образец однократно инъецируют белым мышам массой 14-16 г в дозе 0,3 см 3 подкожно, на 12-14-й день мышей заражают внутрибрюшинно живой культурой гомологичных штаммов в дозе 2 ЛД 50, наблюдают за состоянием животных в течение 3 суток, затем выживших животных подвергают декапитации для получения сыворотки крови и смотрят титр антител в РА. Пример 5. Условия хранения протективных антигенов, выбранных изКМИЭВ-98,КМИЭВ-39 А,КМИЭВ-38. Протективные антигены кишечной палочки хранят в плотно закрытых стерильных флаконах при температуре 4 С в защищенном от света месте. Источники информации 1. Бедоева З.М. Тест-системы для иммунологического мониторинга и прогнозирования острых кишечных инфекций животных и усовершенствование средств специфической профилактики Автореф. дис.докт. биол. наук. - М., 2006. - 51 с. 2. Патент 10886, МПК С 12 1/20, 2007. 3. Патент 10978, МПК С 12 1/20, 2006. 4. Костина, Т.Н. К вопросу о механизмах химической инактивации // ЖМЭИ. - 1981.8. - С. 25-30. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5