Способ дифференциальной диагностики Х-сцепленной и аутосомно-рецессивной формы агаммаглобулинемии

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХСЦЕПЛЕННОЙ И АУТОСОМНО-РЕЦЕССИВНОЙ ФОРМЫ АГАММАГЛОБУЛИНЕМИИ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии(72) Авторы Шарапова Светлана Олеговна Белевцев Михаил Владимирович Алешкевич Светлана Николаевна Мигас Александр Александрович(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр детской онкологии,гематологии и иммунологии(57) Способ дифференциальной диагностики Х-сцепленной и аутосомно-рецессивной формы агаммаглобулинемии, заключающийся в том, что, используя моноклональные антитела 19, 10, 34, проводят иммунофенотипический анализ от 200000 до 500000 клеток костного мозга пациента, выявляют 19 клетки, идентифицируют про-Влимфобласты по экспрессии 191034, пре-В-лимфобласты - по экспрессии 191034, и диагностируют Х-сцепленную агаммаглобулинемию при выявлении блока дифференцировки В-лимфоцитов на стадии пре-В-лимфобластов или аутосомно-рецессивную агаммаглобулинемию при выявлении блока дифференцировки В-лимфоцитов на стадии про-В-лимфобластов. Изобретение относится к медицине, к иммунологии и гематологии, а именно к диагностике врожденной агаммаглобулинемии (первичному иммунодефициту). Врожденная агаммаглобулинемия - это наследственное заболевание иммунной системы, дефицит гуморального звена, вызванный блоком дифференцировки В-лимфоцитов в костном мозге, которое характеризуется низким уровнем/отсутствием иммуноглобулинов в сыворотке крови и отсутствием циркулирующих -лимфоцитов ( 19 лф 2 ). Данный иммунодефицит существует в двух формах -сцепленной и аутосомнорецессивной. 16681 1 2012.12.30 Около 80-85 пациентов с врожденной агаммаглобулинемией - мальчики, в большинстве случаев при тщательном анализе семейной истории можно выявить наследование по материнской линии, подтверждающее агаммаглобулинемию, сцепленную с хромосомой (- , ) 1. Данный диагноз вызван мутацией в гене ВТ, локализованном на Х-хромосоме. Ген кодирует белок с протеазной активностью, известный как ВТ (, Брутон тирозин киназа), необходимый для нормальной дифференцировки -лимфоцитов. ВТК экспрессируется не только в лимфоцитах, но и в моноцитах, тромбоцитах периферической крови человека. У пациентов с низким количеством -лимфоцитов возможна детекция внутриклеточной экспрессии протеина в других типах клеток с помощью моноклональных антител методом проточной цитофлуорометрии. Отсутствие ВТ точно подтверждает , но для выявления генетической основы требуется мутационный анализ. Но, учитывая, что белок кодируется Ххромосомой, то в большинстве случаев мамы являются носителями патологического гена,и при исследовании у них экспрессии ВТ в моноцитах можно выявить две популяции одна с нормальным уровнем белка, другая с нарушенной экспрессией 2. Это явление вызвано рандомной инактивацией либо нормальной -хромосомы, либо патологической. В некоторых случаях при мутации гена ВТ возможна экспрессия белка ВТ, который практически не функционирует. Недостаток известных способов невозможно провести дифференциальную диагностику агаммаглобулинемии, сцепленной с -хромосомой и агаммаглобулинемией с аутосомно-рецессивным типом наследования, так как при некоторых мутациях в гене ВТ белок ВТ все-таки экспрессируется в моноцитах, что может дать ложноположительный результат определения вида агаммаглобулинемии. Агаммаглобулинемия с аутосомно-рецессивным типом наследования встречается гораздо реже -сцепленной 3. Болеют как мальчики, так и девочки. В иммунограмме такие же результаты как при агаммаглобулинемии Брутона, но за патогенез отвечают пять разных генов ген тяжелой -цепи,(79), , 5, 8. Продукт каждого из этих генов играет важную роль в созревании предшественников -лимфоцитов, и, следовательно, пациенты имеют очень низкое число -лимфоцитов в периферической крови. Возможности проточной цитометрии позволяют определять продукты почти всех описанных генов путем внутриклеточной детекции в образцах костного мозга пациентов. Недостатком приведенного исследования является то, что авторы исследуют только аутосомную агаммаглобулинемию, предлагают догоростоящую методику для определения мутаций в ряде генов. Дефекты вышеописанных генов приводят к остановке дифференцировки лимфоцитов на стадии от про- к пре- в костном мозге, что на стадию раньше, чем при агаммаглобулинемиии Брутона 4. Недостатком является то, что не исследуют образцы здорового костного мозга для выявления числа предшественников -лимфоцитов. Задача предполагаемого изобретения состоит в том, чтобы провести дифференциальную диагностику -сцепленной и аутосомно-рецессивной форм агаммаглобулинемии для выбора пациентов для мутационного анализа гена ВТ и дальнейшего генетического консультирования семьи. Поставленную задачу решают тем, что осуществляют дифференциальную диагностику -сцепленной и аутосомно-рецессивной форм агаммаглобулинемии путем проведения поверхностного иммунофенотипического анализа предшественников -лимфогемопоэза в образце цельного костного мозга, основанного на использовании моноклональных антител с определенной специфичностью (контроль изотипа антител, 10, 34, 19). Диагностируют аутосомно-рецессивную форму агаммаглобулинемии в костном мозге пациента при относительном содержании проклеток (191034) от общего количества В-лимфоцитов (19) более 75 , проводят анализ про-В-клеток путем вы 2 16681 1 2012.12.30 ставления вторых ворот на живых В-лимфоцитах 19 по экспрессии маркеров 10 и 34 на 19 В-клетках. 191034 анализируют как проклетки,191034 как пре-1-клетки, 191034 как зрелые -клетки. сцепленную форму агаммаглобулинемии диагностируют при блоке дифференцировки на стадии от про- к прелимфобластам (проклеток от 19 равно и менее 75 ). Для проведения иммунофенотипического анализа необходимо записывать от 200000 до 500000 клеток костного мозга пациента. Способ осуществляют следующим образом. Способ включает определение субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга, основан на использовании цельного костного мозга костный мозг набирают в пробирки с консервантом (ЭДТА) в объеме от 2,5 до 5,0 мл в зависимости от клеточности образца. Костный мозг разливают по 100 мкл в 5-мл полистиреновые пробирки ( , ) и добавляют по 10 мкл каждого из моноклональных Ат контроль изотипа антител,10 , 34 РЕ,19 РС-5 (РС-7). Образцы инкубируют в станции пробоподготовки 10 минут при комнатной температуре. Затем автоматически станция раскапывает оригинальные((лизирующий и фиксирующий растворы в образцы, которые через 20 минут готовы для записи на проточном цитофлуориметре 500 ( ). Анализ полученных данных на проточном цитофлуориметре приведен на фиг. 1 дифференцировка -лимфоцитов здорового донора. На фиг. 1 А показаны данные проточного цитофлуориметра, нормальное светорассеяние лейкоцитов и лимфоцитов костного мозга. По этим данным выставляют первые ворота на живых лимфоцитах по / костного мозга. На фигуре 1 Б показаны данные проточного цитофлуориметра, по которым выставляют вторые ворота на живых В-лимфоцитах 19. На фигуре 1 В показана экспрессия маркеров 10 и 34 на В-клетках здорового костного мозга. 191034 проклетки 191034 пре-В 1-клетки, 1910 34 зрелые -клетки. На фиг. 2 представлены данные проточной цитофлуориметрии, отражающие блок дифференцировки В-лимфоцитов в костном мозге у пациентов с -сцепленной агаммаглобулинемией и аутосомно-рецессивной формой агаммаглобулинемии. На фиг. 2 А видно, что дифференцировка В-лимфоцитов остановлена на стадии 191034 пре 1-клеток, что соответствует -сцепленной агаммаглобулинемии. На фигуре 2 Б остановка дифференцировки на стадии 191034 проклетки (88,7 от 19). Для осуществления способа необходимо учитывать, что число -лимфоцитов у пациентов с агаммаглобулинемией резко снижено и в костном мозге, для анализа данных популяций необходимо записывать большое количество клеток (200000-500000) для возможности анализа -клеток. Данный способ диагностики апробирован на 12 пациентах с агаммаглобулинемией. У пяти пациентов проведено исследование блока дифференцировки -лимфоцитов в костном мозге методом проточной цитометрии. Для контроля исследованы образцы костного мозга здоровых доноров (из Германии) для трансплантации детям с онкогематологической патологией в РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии. При исследовании костного мозга у пациентов с агаммаглобулинемией выявлено, что у 3 пациентов блок дифференцировки -клеток в костном мозге на стадии 191034 проклетки (процент проклеток от 19 более 75 ), у 2 пациентов - на стадии 191034 пре-1-клеток, что соответствует -сцепленной агаммаглобулинемии (проклеток от 19 равно и менее 75 ). У всех пациентов с блоком дифференцировки на стадии пре-1 обнаружена мутация в гене ВТ. Данные представлены в таблице. 16681 1 2012.12.30 Основным преимуществом предлагаемого способа дифференциальной диагностики по сравнению с известными и уже существующими способами является возможность разделения двух видов агаммаглобулинемии, которые клинически проявляются одинаково, но имеют различную патогенетическую основу. Отличительные признаки нашего изобретения способ дешевле, методологически проще в исполнении,диагностический результат можно получить в течение часа после забора костного мозга. Относительное содержание ( от -лимфоцитов по 19) субпопуляций предшественников -лимфопоэза у пациентов с агаммаглобулинемией 191034 1910 1910 Пациент 191034,3434 Пациент 1 68,4 0,6 1,7 0,6 Пациент 2 37,6 0 4 0 Пациент 3 79 1,5 5,3 3 Пациент 4 87,9 2,2 0,2 5,5 Пациент 5 88,7 3,8 0 7,5 Клинические примеры, иллюстрирующие заявляемый в качестве изобретения способ диагностики. Пример 1. Больной М.А. 2006 г.р. до 2 месяцев находился на грудном вскармливании, брат болен врожденной агаммаглобулинемией. В анамнезе ОРВИ, острые кишечные заболевания не инфекционной этиологии, анемия, ветряная оспа. При поступлении в РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии в двухлетнем возрасте у больного обнаружено полное отсутствие иммуноглобулинов в сыворотке крови (0,0 г/л, 0,05 г/л,0,01 г/л) и -лимфоцитов 190(норма 5-15 ). При типировании костного мозга на предмет дифференцировки В-лимфоцитов обнаружен блок на стадии от про- к пре-1-клеток 191034 пре-1-клеток (68,4 проклеток, что меньше 75 ), в дальнейшем был выполнен мутационный анализ гена ВТ и обнаружена мутация 000061. 1287. Данная мутация обнаружена и у брата. Выставлен диагноз - Хсцепленная агаммаглобулинемия. Пример 2. Больной Ш.В. 1993 г.р. У матери отродовбеременности,ребенок умер в 1 год 10 мес. (патологоанатомический диагноз - генерализованная вирусная инфекция), сестра больна агаммаглобулинемией. Заболел в 11 месяцев, после 1 года неврит седалищного нерва с вялым парезом правой ноги, вакцин-ассоциированный полиомиелит (ВАМП) был подтвержден. В анамнезе частые ОРИ, подмышечный левосторонний гидроденит. В иммунограмме при поступлении в РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии-лимфоциты - 0 ,1,03 г/л,0,04 г/л,0,05 г/л. В костном мозге блок дифференцировки на стадии 191034 проклетки (процент проклеток от 1987 ). Диагностирована агаммаглобулинемия с аутосомно-рецессивным типом наследования. Таким образом, предлагаемый способ дифференциальной диагностики является быстрым, информативным, надежным и может быть рекомендован для использования в медицинских учреждениях Министерства здравоохранения Республики Беларусь. Источники информации 1.Т.// . - 1998. - . 91. - . 2. - Р. 595-602. 4 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5