Способ получения каталазы

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Михайлова Раиса Владимировна Мороз Ирина Викентьевна Павловская Жанна Ивановна Лобанок Анатолий Георгиевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56) МОРОЗ И.В. и др. Доклады национальной академии наук Беларуси.2009. - Т. 53. -4. - С. 77-81. МОРОЗ И.В. и др. Микробные биотехнологии фундаментальные и прикладные аспекты Сб. научн. трудов. Минск, 2007. - С. 48-55. СЫРБУ Т.Ф. Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. МатериалыМеждународной научной конференции. Т. 1. - Минск, 2008. - С. 237-239....(57) Способ получения каталазы, включающий выращивание посевного материала грибаБИМ -371 Д, внесение его в питательную среду с последующим глубинным культивированием гриба в условиях аэрации и отделением содержащей каталазу культуральной жидкости от биомассы гриба, отличающийся тем, что выращивание посевного материала гриба осуществляют на агаризованной среде Чапека с 6,0 глюкозы и 0,008-0,024, а посевной материал вносят в питательную среду, содержащую глюкозу, мас.6,0 3, мас.0,8 24, мас.0,1, мас.0,05 472, мас.0,05 472, мас.0,001 экстракт солодовых ростков, мас.2,0 этанол, об.4,0 рибофлавин, мМ 0,05-0,5 воду остальное,и проводят глубинное культивирование в течение 96 часов при температуре 26 С, причем аэрацию среды осуществляют перемешиванием с интенсивностью 230-250 об/мин. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения путем микробиологического синтеза внеклеточных каталаз, которые применяются в процессах 16456 1 2012.10.30 детоксикации остаточных количеств 22, используемых в технологиях легкой, химической, пищевой промышленности и в медицине. Каталаза является компонентом комплексной ферментной системы защиты клеток про- и эукариотических организмов от токсичных соединений кислорода и широко распространена в природе. Фермент обнаруживается в клетках практически всех аэробных организмов. Каталазы продуцируют микроорганизмы различных таксономических групп бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы. Следует отметить, что каталазы грибов наиболее эффективно катализируют реакцию разложения пероксида водорода, так как обладают наименьшей энергией активации и отличаются высокой устойчивостью к физикохимическим факторам, поэтому мицелиальные грибы являются наиболее перспективными продуцентами каталаз. Известно, что продуцентами каталаз являются грибы родови . Локализация каталазы может быть как внеклеточной, так и внутриклеточной. Известен способ получения каталазы 10 (внутриклеточной(65,2 ед/мл) и внеклеточной (39,0 ед/мл при глубинном культивировании. Данный способ предусматривает культивирование гриба на питательной среде, содержащей глюкозу 80 , дрожжевой экстракт - 0,5 , (3)2 - 0,1 , 24 - 0,1 , 3 - 1,0-2,5 . Недостатком данного способа является необходимость поддержания определенного уровняпитательной среды путем введения в среду нерастворимой соли (3 - 1,0-2,5 ),богатая среда, включающая глюкозу (8 ) и дрожжевой экстракт (0,5 ), необходимость поддержания при культивировании высокой температуры (30 С), что делает процесс энергоемким, и образование при выращивании гриба сопутствующего фермента - внеклеточной глюкозооксидазы, затрудняющей процесс очистки каталазы, сложность и трудоемкость процесса очистки внутриклеточной каталазы 1. Известен способ получения каталазы на основе штамма 16, который предусматривает глубинное культивирование гриба при 28 С при перемешивании 400 об/мин и аэрации 1 л/л среды в мин в течение 96 ч на питательной среде (исходный 6,0), содержащей (на 1 л) глюкозу - 80 г, 3 - 5,0 г, 24 - 1,0 г, 472 0,01 г,- 0,5 г, пептон - 3,0 г, 3 - 35 г. Посевной материал выращивают на агаре с кукурузным экстрактом. Засев производят 96 ч споровой суспензией (титр спор 5,0106). Недостатком данного способа является необходимость поддержания определенного уровняпитательной среды путем введения в среду нерастворимой соли (3), необходимость поддержания при культивировании высокой температуры (28 С), что делает процесс энергоемким, и образование при выращивании гриба сопутствующего фермента внеклеточной глюкозооксидазы, затрудняющей процесс очистки каталазы 2. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения внеклеточной каталазы на основе-648 3 3. Данный способ предусматривает культивирование гриба-продуцента на питательной среде (исходный 5,0), содержащей (на 1 литр) глюкозу - 60 г, 3 - 8,0 г, 24 - 1,0 г,472 - 0,5 г,- 0,5 г, 472 - 0,01 г, экстракт солодовых ростков 20 мл, этанол - 40 мл. Посевной материал выращивают в пробирках. Засев производят спорами гриба (9,0-9,7106 спор на 1 мл питательной среды), используя культуру 0,5 месячного возраста, выращенную на модифицированной агаризованной среде Чапека с 6 глюкозы и 2,9 мМ 22. Гриб культивируют в колбах на качалке с 180 об/мин при 2527 С в течение 4 суток. Уровень образования каталазы, синтезируемой-648 3, составляет 492,75 ед/мл культуральной жидкости, а продуцирующая способность мицелия - 77,60 ед/мг биомассы. Недостатками данного способа являются использование в агаризованной среде для получения посевного материала пероксида водорода, который способен самопроизвольно разлагаться на воду и кислород недостаточно высокий уровень синтеза каталазы продуцентом, что усложняет и удорожает процесс его очистки. 2 16456 1 2012.10.30 Задачей данного изобретения является разработка способа получения внеклеточной каталазы грибного происхождения, характеризующейся высокой активностью, упрощение и удешевление процесса. Поставленная задача решается путем 1) получения на агаризованной модифицированной среде Чапека с глюкозой с сернокислой солью железа (0,01 ) посевного материалаБИМ -371 Д 2) глубинного культивирования продуцента на питательной среде с 6 глюкозы, содержащей дополнительно рибофлавин (0,1 мМ), при интенсивности перемешивания среды 230-250 об/мин и соотношении объема среды и объема колбы, равном 0,15 3) последующим отделением биомассы и использованием фильтрата культуральной жидкости для получения препаратов каталаз. ШтаммБИМ -371 Д (-648 3) депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (научной коллекции типовых и промышленно-ценных непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси). Культура также поддерживается в коллекции мицелиальных грибов лаборатории ферментов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси. Штамм-прототип поддерживается и хранится при 4-6 С на агаризованной модифицированной среде Чапека,содержащей глюкозу (6 ) и пероксид водорода (2,9 мМ). Заявляемый способ иллюстрируют нижеприведенные примеры его конкретного осуществления. Пример 1. Первым этапом осуществления заявляемого способа является разработка метода длительного хранения продуцента, обеспечивающего сохранность его морфолого-биохимических свойств. Известно, что усилить процесс диссоциации культуры или, наоборот,стабилизировать ее можно изменением состава и концентрации компонентов питательной среды.БИМ -371 Д поддерживают на агаризованных средах Чапека с глюкозой с добавлением 22 или Чапека с добавлением сернокислой соли железа(0,005-0,1 ). Культуру пересевают 1 раз в 2-3 месяца на вышеуказанные среды. Для анализа биохимической стабильности штамм культивируют на питательной среде следующего составаглюкоза - 6,0 3 - 0,8, 24 - 0,1,- 0,05,472 - 0,05, 472 - 0,001, экстракт солодовых ростков - 2,0, этанол 4 об. , остальное - вода, исходный -5,0-5,2. В качестве посевного материала используют споровую суспензию (9,6105 спор/мл среды) гриба, выращенного на вышеуказанных агаризованных средах при 26 С в течение 14 сут. Культивирование грибов ведут глубинно в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл питательной среды на круговой качалке (180-200 об/мин) при температуре 26 С в течение 96 ч. По окончании культивирования биомассу гриба отделяют фильтрованием. В фильтрате культуральной жидкости определяют активность каталазы 4. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое катализирует образование 1 микромоля 22 в течение 1 мин при 0 С. Представленные в табл. 1 данные показывают, что в результате использования для поддержания и получения посевного материала .БИМ -371 Д агаризованной среды с сернокислой солью железа увеличивается уровень синтеза фермента и снижается коэффициент вариации, что свидетельствует о стабилизации культуры. Коэффициент вариации находился в пределах 6,4-7,3 , что ниже данного показателя контрольного варианта (8,9 ). Установлено, что оптимальной для поддержания и хранения штамма является среда Чапека с глюкозой и сернокислой солью железа (0,01 ). Таким образом, увеличение в 10 раз содержания сернокислой соли железа (до конечной концентрации 0,01 ) в агаризованной модифицированной среде Чапека с глюкозой для поддержания и храненияБИМ -371 Д вместо используемого ранее пероксида водорода (2,9 мМ) позволяет не только стабилизировать культуру, но и увеличить на 29(в 1,3 раза) уровень синтеза каталазы грибом. 3 16456 1 2012.10.30 Таблица 1 Влияние условий получения посевного материала на синтез внеклеточной каталазы .БИМ -371 Д Агаризованная среда для поддержания Активность внеклеточКоэффициент и хранения продуцента ной каталазы, ед/мл вариации 0,005491,9315,24 0,0087,3 615,5118,84 0,016,4 635,6518,43 Чапека с глюкозой и 4 0,026,5 613,4218,40 0,05561,7418,54 0,1456,4014,60 Чапека с глюкозой и 2,9 мМ 22 8,9 492,7515,62(прототип) Пример 2. Мицелиальный гриб .БИМ -371 Д культивируют в условиях, аналогичных описанным в примере 1, но в питательную среду добавляют 0-1,0 мМ рибофлавина (витамин 2). Таблица 2 Синтез внеклеточной каталазы .БИМ -371 Д на питательных средах различного состава Активность внеклеточной каталазы Концентрация рибофлавина, мМ ед/мл ед/мг 0 635,6518,43 100,103,20 0,01 689,9221,13 109,733,41 0,05 782,2327,38 110,3435,30 0,1 831,7124,95 112,023,69 0,5 757,5621,96 101,213,34 1,0 709,2323,04 96,843,09 Как видно из табл. 2, в присутствии в питательной среде 0,1 мМ рибофлавина уровень синтеза фермента грибом увеличился на 31(в 1,3 раза). Пример 3. Образование ферментов мицелиальными грибами в значительной степени зависит от аэрации питательной среды. Обеспечение микробной клетки кислородом определяется количеством подаваемого воздуха, а также интенсивностью механического перемешивания среды. Условия примера соответствуют описанным в примере 1, за исключением того,что .БИМ -371 Д выращивают в 0,75-литровых колбах Эрленмейера с различным объемом оптимизированной питательной среды, содержащей 0,1 мМ рибофлавина и 6 глюкозы, на качалке с 180-200 или 230-250 об/мин. Отношение объема питательной среды к объему колбы (показатель /) составляло 0,07-0,30 . Как следует из приведенных в табл. 3 данных, глубинное выращивание .БИМ-371 Д при перемешивании питательной среды со скоростью 230-250 об/мин и соотношении объема среды и объема колбы, равном 0,15, обеспечивает высокий уровень образования фермента и продуцирующей способности мицелия. При культивировании .БИМ -371 Д на оптимизированной среде в указанных условиях уровень синтеза каталазы превосходит в 2,7 аналогичный показатель, указанный в прототипе. 16456 1 2012.10.30 Таблица 3 Влияние режима аэрации питательной среды на синтез внеклеточной каталазы .БИМ -371 Д Скорость механического Отношение объема Активность внеклеточной каталазы перемешивания питательпитательной среды ед/мл ед/мг ной среды, об/мин к объему колбы,0,07 953,3329,62 112,313,61 0,10 915,2226,54 112,163,52 180-200 0,15 808,2725,86 111,973,46 0,20 786,4125,17 109,243,24 0,30 754,2223,38 105,423,35 0,07 1309,5140,11 113,473,58 0,10 1314,7039,41 118,023,43 230-250 0,15 1314,8239,44 119,453,67 0,20 1308,3439,25 119,153,54 0,30 1002,2533,07 118,793,66 Рекомендуемые оптимизированная питательная среда (п. 2) и условия культивирования (п. 3) были использованы авторами и для другого имеющегося у нас штаммапродуцента каталазы - .БИМ -370 Д, который проявляет по рекомендуемому способу активность каталазы 653,50 ед/мл, что свидетельствует о пригодности данного способа и для других представителей вида. Уровень образования каталазы обеими штаммами по предлагаемому способу в 1,3-2,7 раза выше, чем в прототипе (492,75 ед/мл). Преимущества предлагаемого способа получения каталазы 1. Стабилизация свойств продуцента и увеличение на 29 уровня синтеза фермента за счет использования для поддержания продуцента и получения посевного материала агаризованной среды Чапека с 0,01 сернокислой соли железа. 2. Увеличение продукции фермента на 31 за счет оптимизации состава питательной среды путем добавления 0,1 мМ рибофлавина. 3. Повышение в 2,7 раза уровня синтеза каталазы за счет оптимизации режима аэрации питательной среды - использование механического перемешивания питательной среды со скоростью 230-250 об/мин при соотношении объема среды и объема колбы, равном 0,15. Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет повысить продукцию каталазы .БИМ -371 Д, стандартизировать условия осуществления процесса и повысить его рентабельность. Источники информации 1..,.// . . . - 1997. - . 37. - . 2. - . 85-91. 2...(16)//. . - 1995. - . 17. - . 336-339. 3. Мороз И.В. и др. Сравнительная характеристика каталаз, синтезируемых-648 3 в различных условиях культивирования // Докл. НАН Беларуси. - 2009. Т. 53. -4. - С. 77-81 (прототип). 4. Методы экспериментальной микологии / Под ред. В.И.Билай. - Киев Наукова думка, 1973. - 243 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5