Способ получения внеклеточной бета-галактозидазы

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Сапунова Леонида Ивановна Тамкович Ирина Олеговна Лобанок Анатолий Георгиевич Костеневич Александр Александрович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56) САПУНОВА Л.И. и др. Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. МатериалыМеждународной научной конференции. Т.1. - Минск. - 2008. С. 171-173.1082812 , 1984.2141521 1, 1999.2313572 2, 2007.1509402 1, 1989...(57) Способ получения внеклеточной -галактозидазы, включающий глубинное культивирование бактериального штамма-продуцента и последующее отделение культуральной жидкости, содержащей -галактозидазу, от бактериальной биомассы, отличающийся тем,что в качестве бактериального штамма-продуцента используют штаммБИМ В-499-Д, выращенный на питательной среде, содержащей лактозу, а глубинное культивирование проводят при температуре 27-29 С и исходном 6,5 на питательной среде следующего состава, мас.лактоза 1,25-1,75 пептон 0,75-1,00 дрожжевой экстракт 0,075-0,100 472 0,25-0,30 24 0,25-0,30 вода остальное. Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, предназначено для получения фермента, применяемого в пищевой промышленности для производства безлактозных диетических продуктов питания из цельного молока или отходов его переработки,глюкозо-галактозного сиропа, в фармацевтической промышленности - в качестве ферментативно активной субстанции для производства лекарственных средств, корректирующих лактазную недостаточность, в сельском хозяйстве - для производства кормов и кормовых 15050 1 2011.10.30 добавок и касается способа получения -галактозидазы уникальной для прокариот внеклеточной локализации. Известно, что синтез -галактозидазы является широко распространенным свойством про- и эукариотических микроорганизмов различной таксономической принадлежности. Причем ферменты эукариот являются, как правило, внеклеточными, а прокариот - внутриклеточными или ассоциированными с поверхностью клеток. Кроме того, первые предпочтительно гидролизуют специфический субстрат в условиях высокой ( 2,5-5,0), а вторые - низкой ( 6,0-8,0) кислотности среды. В литературе указывается на способность отдельных представителей прокариот продуцировать секретируемые формы -галактозидазы 1-4. Основными недостатками штаммов-продуцентов являются либо невысокие уровни синтеза -галактозидаз, либо их низкая удельная активность, либо очевидная клеточносвязанная, а не, как указывается,внеклеточная локализация синтезируемых ферментных белков, либо все перечисленное одновременно. Это усложняет процесс выделения и очистки фермента, делая процесс длительным, материало- и энергозатратным. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения -галактозидазы с использованием бактерий.3088 5, 6. Максимальная величина ферментативной активности, варьирующая в пределах 519 ед/мл, выявляется в бесклеточном фильтрате 12-суточной культуры, когда рост штамма-продуцента полностью завершен и происходит лизис клеток. Максимальная удельная активность -галактозидазы к этому времени составляет 1,23 ед/мг белка. К недостаткам указанного способа следует отнести наличие в питательной среде для глубинного культивирования продуцента большого количества (2,05 ) органических источников азота, что удорожает процесс получения фермента и усложняет его очистку использование большого количества посевного материала (5 об. ), высокий температурный режим культивирования (37 ) и необходимость существенного (6-кратного, с 2 до 12 сут.) продления сроков культивирования бактерий после завершения их роста с целью секреции -галактозидазы в культуральную жидкость, что делает процесс энергоемким и экономически малопривлекательным низкую удельную активность -галактозидазы в фильтрате культуральной жидкости бактерий (1,23 ед/мг белка), что свидетельствует о высокой концентрации балластных белков и обусловливает сложность дальнейшей очистки ферментного белка использование в качестве штамма-продуцента -галактозидазы спорообразующих бактерий рода , что в условиях выпуска современными микробиологическими производствами широкого спектра продукции требует соблюдения особенно тщательного режима стерилизации технологического оборудования и помещений. Задачей изобретения является разработка способа получения внеклеточной -галактозидазы бактериального происхождения, характеризующейся высокой общей и удельной активностью, а также упрощение и удешевление процесса. Поставленная задача реализуется путем приготовления на содержащих лактозу средах физиологически активного посевного материала штамма неспорообразующих бактерийЛФ-ГАЛ - продуцента -галактозидазы, его глубинного выращивания в ферментационной емкости с питательной средой, содержащей источники углеродного, азотного и минерального питания, с перемешиванием при 6,5 и температуре 27-29 в течение не более 3 сут. Штамм-продуцент -галактозидазыЛФ-ГАЛ хранится в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологииБеларуси под номером БИМ В-499-Д. Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется следующими примерами. 2 15050 1 2011.10.30 Пример 1. БактерииЛФ-ГАЛ (БИМ В-499-Д) культивируют в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл питательной среды на качалке (150-180 об/мин) при температуре 27-29 в течение 4 сут. (в прототипе - 37 , 12 сут.). Питательная среда содержит (в ) лактозу - 3,0 пептон - 1,0 дрожжевой экстракт 0,5 24 - 0,3 472 - 0,2 исходный- 6,5. В качестве посевного материала используют 2 об.суспензии бактериальной культуры (5 об.в прототипе), полученной на пептонно-дрожжевом агаре (впептон - 1,0 дрожжевой экстракт - 0,5 глюкоза - 0,5- 0,5 агар-агар - 1,5) при 7,2-7,4 и температуре 24-26 в течение 3 сут. По окончании процесса культивирования клетки бактерий отделяют центрифугированием (5000-6000 об/мин, 15 мин), и в бесклеточном фильтрате культуральной жидкости определяют количество белка и активность -галактозидазы. За единицу -галактозидазной активности принимают количество фермента, гидролизующего при 40 и 7,0 за 1 мин 1 мкмоль о-нитрофенилгалактопиранозида с образованием 1 мкмоля 4-нитрофенола. Активность -галактозидазы выражают в ед/мл фильтрата культуральной жидкости (ед/мл) или в ед/мг белка (удельная активность). Активность -галактозидазы бесклеточного фильтрата культуральной жидкости бактерий составляет 24,7 ед/мл или 138,0 ед/мг белка. Пример 2. Штамм ЛФ-ГАЛ (БИМ В-499-Д) бактерийвыращивают в описанных в примере 1 условиях на питательной среде следующего состава (в ) лактоза 1,0 пептон - 0,75 дрожжевой экстракт - 0,2 472 - 0,20 24 - 0,3, за исключением того, что в качестве посевного материала используют 2 об.суспензии клеток бактерий, полученных на жидкой среде указанного выше состава при 27-29 в течение 18-24 ч. Активность внеклеточной -галактозидазы по окончании культивирования штаммапродуцента составляет 32,4 ед/мл или 143,6 ед/мг белка. Пример 3. БактерииЛФ-ГАЛ (БИМ В-499-Д) выращивают в колбах Эрленмейера объемом 750 мл со 150 мл питательной среды следующего состава (в ) лактоза - 1,5 пептон - 1,0 дрожжевой экстракт - 0,1 472 - 0,25 24 - 0,3,при исходном 6,5 на качалке со скоростью вращения платформы 250 об/мин при температуре 27-29 в течение 2 сут. В качестве посевного материала используют 2 об.суспензии клеток бактерий, выращенных в жидкой среде вышеуказанного состава при 2729 в течение 3 сут. По окончании культивирования штамма-продуцента активность внеклеточной -галактозидазы составляет 41,8 ед/мл или 148,5 ед/мг белка. Пример 4. Для выращивания бактерийЛФ-ГАЛ (БИМ В-499-Д) используют среду, содержащую (в ) лактозу - 1,25 пептон - 0,75 дрожжевой экстракт 0,075 4-72 - 0,3 24 - 0,25. Условия получения посевного материала и физико-химические условия культивирования аналогичны указанным в примере 3.-Галактозидазная активность в фильтрате культуральной жидкости достигает максимума ко вторым суткам роста бактерий и составляет 38,3 ед/мл или 146,1 ед/мг белка. Пример 5. БактерииЛФ-ГАЛ (БИМ В-499-Д) выращивают на качалке(250-280 об/мин) в колбах Эрленмейера объемом 2000 мл, содержащих 300 мл питательной среды приведенного в примере 3 состава с исходным значением 6,5, при температуре 27-29 в течение 2 сут. В качестве посевного материала используют 2 об.3 15050 1 2011.10.30 суспензии клеток бактерий, полученных в жидкой среде с 0,1 лактозы при 24-26 в течение 18 ч. По окончании культивирования штамма-продуцента активность внеклеточной -галактозидазы составляет 43,6 ед/мл фильтрата культуральной жидкости или 160,6 ед/мг белка. Как следует из сравнительных данных, приведенных в таблице, предлагаемый способ получения внеклеточной -галактозидазы по сравнению со способом-прототипом сокращает длительность процесса в 4-6 раз (с 12-ти до 2-3-х сут) и обеспечивает повышенный в 1,3-8,7 раза уровень синтеза ферментного белка и в 112,2-130,6 раза - более высокую его удельную активность. Сравнительная характеристика синтеза внеклеточной -галактозидазы бактериямиЛФ-ГАЛ (БИМ В-499-Д) и.3088 (прототип) КолиАктивность Содержачество Длитель-галактозидазы ние оргапосев- ность Температура Штамм-продуцент нического ед/мл ного культи- культивироисточника культу-галактозидазы мате- вировавания,ед/мг белка азота в ральной риала, ния, сут. среде,жидкости(БИМ В-499-Д).5 12 37 2,05 5,0-19,0 1,23 3088 (прототип) Таким образом, заявляемый способ получения -галактозидазы бактериального происхождения превосходит известные аналоги по таким важнейшим показателям как бесспорно внеклеточная локализация фермента, продуцируемого неспорообразующими бактериямиЛФ-ГАЛ (БИМ В-499-Д) увеличенный в 1,3-8,7 раз уровень синтеза ферментного белка повышенная в 112,2-130,6 раза его удельная активность пониженное в 1,9-2,5 раза содержание органических источников азота в среде и в 2,5 раза - количество посевного материала сокращенный в 4-6 раз период реализации способа при пониженной на 8-10 температуре. Использование предлагаемого способа обеспечивает по сравнению с прототипом упрощение процесса получения препарата-галактозидазы высокой степени очистки, сокращение его длительности, что ведет к существенному снижению материало-, трудо- и энергозатрат, удешевлению производства фермента и повышению его рентабельности. Источники информации 1..,Т.,.,.,.,.,.239, , ,// . . . - 2007. - . 73. - . 11. . 2637-3644. 2.,Т.К.,,.,,-.-// . . . - 2006. - . 70. - . 548-557. 4-галактозидазы среди бактерий. Матер.Междунар. науч. конф. Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. - Минск 1-5 июня 2008. Минск Изд. И.П. Логвинов, 2008. . 1. - С. 171-173. 5.,.,,,--//. - 1999. - . 44. - . 4. - . 367-371 (прототип). 6..,,,-.3088 // .. . 2000. - . 24. - . 58-63 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5