Способ определения полярности окружения 1-анилино-8-нафталинсульфоновой кислоты в разведенной сыворотке крови

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛЯРНОСТИ ОКРУЖЕНИЯ 1 АНИЛИНО-8-НАФТАЛИНСУЛЬФОНОВОЙ КИСЛОТЫ В РАЗВЕДЕННОЙ СЫВОРОТКЕ КРОВИ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(72) Автор Ткачев Сергей Викторович(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(57) Способ определения полярности окружения 1-анилино-8-нафталинсульфоновой кислоты (1,8-АНС) в разведенной сыворотке крови, заключающийся в том, что регистрируют стоксов сдвиг флуоресценции 30 мкМ-ного раствора 1,8-АНС в 0,1 -ном растворе сыворотки крови, приготовленном на водном 0,2 М - буфере рН 7,4, в кювете с длиной оптического пути 10 мм при размере щелей монохроматоров возбуждения и испускания 2 нм и температуре 21 С и рассчитывают полярность окруженияв условных единицах 1,8-АНС в разведенной сыворотке крови по формуле-0,002314,9610-5,где х - значение стоксова сдвига, см-1. Изобретение относится к биофизике и биохимии, в данном случае к разделам биофизики и биохимии белка, а также к разделу клинической-лабораторной диагностики. Известен способ оценки полярности окружения 1-анилино-8-нафталинсульфоновой кислоты (1,8-АНС), заключающийся в измерении сдвига максимума испускания флуоресцентного зонда - 1,8-АНС в зависимости от изменения полярности места его связывания 1. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является использование в оценке полярности поверхности белков 1,8-АНС. Недостатком данного способа является то, что он обладает низкой точностью и дает приблизительные значения изменения полярности белка. Задачей заявляемого изобретения является повышение точности и чувствительности за счет выявления зависимости между полярностью окружения зонда и стоксовым сдвигом его флуоресценции. 12996 1 2010.04.30 Поставленная задача достигается следующим образом предложен способ определения полярности окружения 1,8-АНС в разведенной сыворотке крови, заключающийся в том,что регистрируют стоксов сдвиг флуоресценции 30-мкМ-ного раствора в 0,1 -ном растворе сыворотки крови, приготовленном на водном 0,2 М - буфере 7,4, в кювете с длиной оптического пути 10 мм при размере щелей монохроматоров возбуждения и испускания 2 нм и температуре 21 С и рассчитывают полярность окружения у в условных единицах 1,8-АНС в разведенной сыворотке крови по формуле(1) у-0,002314,9610-5 х,-1 где х - значения стоксова сдвига, см . В основе разработанного метода лежит измерение стоксова сдвига флуоресценции в органических растворителях различной полярности. В результате измерений, получаем зависимость стоксова сдвига флуоресценции 1,8-АНС от полярности растворителя. Выявленная зависимость позволяет определить полярность неисследованного окружения 1,8 АНС, поскольку спектральные характеристики зонда 1,8-АНС зависят от полярности его окружения. Учитывая, что специфические взаимодействия (типа водородных связей) между растворителем и 1,8-АНС не оказывают существенного влияния на изменение спектральных характеристик хромофора,эта зависимость будет обусловлена неспецифическими взаимодействиями между дипольным моментом 1,8-АНС и растворителем, влияющим на разность энергий основного и возбужденного состояний 1,8-АНС, и она описывается уравнением Липперта 2 2, 3 где- постоянная Планка, с - скорость света, а - радиус полости, в которой находится хромофор,и- волновые числа, отвечающие положению максимумов спектров по глощения и флуоресценции соответственно,и- дипольные моменты молекулы флуорофора в возбужденном и основном состояниях соответственно. Параметрназывается ориентационная поляризуемость. Он связан с диэлектрическойпроницаемостью среды и коэффициентом преломлениясоотношением 1 2 1.2 21 21 Основной вклад в спектральные сдвиги флуорофора вносит переориентация диполей 1. В молекул растворителя, которая характеризуется первым членом уравнения (1) 21 свою очередь полярность растворителя определяется величиной дипольного момента молекул растворителя чем он больше, тем сильнее полярность. В табл. 1 приведены значенияидля неполярного растворителя гексана и полярного растворителя метанола. Для гексана, не имеющего дипольного момента, переориентации молекул растворителя относительно возбужденного флуорофора не происходит. В данном случае ориентационная поляризуемость , как функция дипольного момента растворителя, будет иметь небольшое значение. В противоположность этому полярный растворитель, метанол, обладает более высоким значениеми, как следствие, более высоким значением 2, 4. Таблица 1 Гексан 1,874 0,0011 Метанол 32,6 0,3083 Исходя из вышеизложенного, ориентационная поляризуемостьраствора может быть рассмотрена как параметр, характеризующий полярность среды 2. Таким образом,Растворители 12996 1 2010.04.30 построение зависимостиможет быть использовано для определения полярности окружения зонда 2. Пример 1. В качестве растворителей с различной полярностью используют бутанол и метанол, а также 5, 10, 50 и 80 растворы метанола в бутаноле. Взаимодействие растворителей и АНС оценивают с помощью графика Липперта, иллюстрирующего зависимость. Для бутанола и метаноласоответственно 17,7 и 32,6 соответственно 1,397 и 1,329 3. Для растворов с различным содержанием компонентовирассчитывают по формулам( )и, гдеисоответственно диэлектрическая постоянная и по казатель преломления компонентовраствора,( ) - их объемная доля в растворе. Ориентационную поляризуемость растворов рассчитывают по формуле 1. В работе используют аммониевую соль 1-анилино-8-нафталинсульфоновой кислоты(, Германия) в конечной концентрации 30 мкМ, метанол и бутанол отечественного производства классификации ЧДА. Спектры поглощения и испускания 1,8-АНС записывают на спектрофлуориметре СМ 2203 (ЗАО Солар, РБ) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм, при постоянной температуре 21 С, размер щелей монохроматора возбуждения и испускания - 2 нм. В табл. 2 приведены значения стоксова сдвига флуоресценции 1,8-АНС в зависимости от полярности среды. Как видно из данных таблицы, с увеличением полярности окружения 1,8-АНС, максимум испускания сдвигается в красную область, также увеличивается стоксов сдвиг флуоресценции 1,8-АНС. Таблица 2 Растворители Стоксов сдвиг, см 100 бутанол 0,2647 5376 95 бутанола 5 метанола 0,2675 5423 90 бутанола 10 метанола 0,2702 5514 50 бутанола 50 метанола 0,2889 5873 20 бутанола 80 метанола 0,3008 6135 100 метанол 0,3083 6221 Фигура иллюстрирует зависимость спектрального сдвига свечения 1,8-АНС от изменения полярности растворителя (график Липперта), где по горизонтали - стоксов сдвиг для 1,8-АНС в растворах различной полярности, см- по вертикали - значения ориентационной поляризуемости для метанола, бутанола и их растворов, усл.ед. Как видно из фигуры, полученная экспериментальная зависимость аппроксимируется линейной функцией и может быть выражена уравнением линейной регрессии(1),у-0,002314,9610-5 х где х - значения стоксова сдвига, полученное экспериментально, у - искомое значение полярности окружения зонда. Таким образом, зная стоксов сдвиг 1,8-АНС можно рассчитать полярность его окружения. Например, экспериментально найденные значения стоксова сдвига флуоресценции 1,8-АНС в сывороточных альбуминах человека и быка составляют соответственно 5430 и 5450 см-, следовательно полярность окружения 1,8-АНС в этих белках, рассчитанная по уравнению 1, составит соответственно 0,267 и 0,268 усл.ед. Пример 2. Настоящий пример иллюстрирует возможность применения описанного способа для оценки полярности окружения 1,8-АНС в белке при изучении влияния алкидной эмали и ее компонентов при их ингаляционном поступлении в организм крыс. Используют беспородных крыс-самок массой 170-210 г. Ингаляционную затравку крыс проводят паровоздушным аэрозолем пентафталевой эмали ПФ-115 и ее основных компонентов - лака ПФ-060 и растворителя нефрас С 4 150/200 на протяжении 4 часов 12996 1 2010.04.30 ежедневно, в течение 3 дней. После прекращения ингаляций крыс декапитируют под эфирным наркозом. Собирают вытекающую из шейных сосудов кровь. Сыворотку крови отделяют от форменных элементов путем центрифугирования (10 мин, 3000 об/мин). Все измерения флуоресценции проводят при условиях (температура, длина оптического пути,конечная концентрация 1,8-АНС), указанных в примере 1. Флуоресценцию 1,8-АНС регистрируют в 0,1 растворе сыворотки крови. Растворы 1,8-АНС и сыворотки крови готовят на водном 0,2 Мбуфере ( - 7,4). В табл. 3 приведены значения стоксова сдвига флуоресценции 1,8-АНС в зависимости от степени полярности окружения, определяемого как . Как видно из данных таблицы, с увеличением полярности окружения 1,8-АНС, максимум испускания сдвигается в красную область, также увеличивается стоксов сдвиг флуоресценции 1,8-АНС. Таблица 3 Стоксов сдвиг 1,8-АНС в Значениярассчитанные Экспериментальные группы сыворотке крови крыс, смпо уравнению (1) Интактные крысы 5376 0,2647 Крысы затравленные эмалью 5423 0,2675 ПФ-115 Крысы затравленные лаком 5514 0,2702 ПФ-060 Крысы затравленные нефрас 5873 0,2889 С 4 150/200 На основании полученного уравнения линейной регрессии (пример 1) и спектральных характеристик 1,8-АНС в сыворотке крови крыс можно рассчитать значениядля окружения зонда в белках сыворотки крови. У интактных крыс значениесоставляет 0,2647,для крыс, затравленных эмалью, лаком и растворителем - 0,2675, 0,2702 и 0,2889 соответственно, т.е. ингаляционное воздействие сопровождается изменением полярности окружения зонда на более гидрофобное. Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа заключается в возможности в принятых физико-химических терминах количественно оценить величину полярности неисследованного окружения 1,8-АНС по известному значению стоксова сдвига флуоресценции 1,8-АНС, а также предсказать стоксов сдвиг флуоресценции 1,8 АНС в известном растворителе по величине его полярности. Данный способ расширяет возможности исследований структуры белка и дает дополнительный критерий оценки его физико-химического состояния. Способ может использоваться в научных лабораториях для оценки модификаций структуры белка, в том числе и при патологических состояниях. Способ прост, не требует значительных финансовых затрат на его осуществление и позволяет повысить точность и качество исследований, что в свою очередь сокращает финансовые расходы по контролю за качеством белоксодержащей продукции. Источники информации Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.