Штамм Pseudomonas putida БИМ В-318Д – деструктор диметилфталата, орто-фталевой кислоты и/или метанола

(54) ШТАММ РЗЕНВОМОЫАБ РНТПЭА БИМ В-318 Д - ДЕСТРУКТОР(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси (ВУ)(72) Авторы Волкова Ксения Владими ровна Самсонова Алисса Самуиловна (ВУ)(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси (ВУ)(57) Штамм Рзеибошопаз рийба БИМ В-318 Д - деструктор диметилфталата, орто-фталевой кислоты и/или метанола.Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для очистки сточных вод предприятий по Производству пластификатора диметилфталата (ДМФ).Преимущество локальной микробной очистки основано на использовании высокоактивных штаммов микроорганизмов-деструкторов, более устойчивых к токсическому действию ингредиентов сточных вод, чем компоненты активного ила, и поэтому находит применение для очистки сильнозагрязненных сточных вод.Известно, что бактериальное расщепление диметилфталата происходит с образованием на первом этапе орто-фталевой кислоты и метанола. В случае неполной трансформации, накапливаясь, эти вешества могут повышать токсичность стоков.Микроорганизмы, способные разрушать невысокие концентрации ДМФ (от 0,02 до 0,1 ) в почве и воде встречаются довольно часто 1, 2. Однако с повышением концентрации ДМФ скорость его микробной деструкции падает. Известно, что ДМФ в концентрации, не превышаюшей 20 мг/Л метаболизируется консорциомумом микроорганизмов в очистном сооружении полностью в течение 50-100 суток инкубации. При моделировании аварийных выбросов с повышением концентрации до 200 мг/л уровень деструкции ДМФ за тот же период составляет только 25 3.Одна из наиболее активных среди известных культур Вас 111115 5 р., при иммобилизации на полиуретановом носителе или в альгинатном геле способна метаболизировать 40 мМНаиболее близкими по технической сушности и достигнутому результату являются консорциум микроорганизмов Кпобососсиз егушгороНз 7 Ф, 14 Ф и 29 Ф, иммобилизован ВУ 11842 С 1 2009.04.30нь 1 х на носителе из капроновых нитей И способных утилизировать смесь эфиров фталевь 1 х кислот (ДМФ, ДБФ и ДЭГФ) в концентрации 1-5 (об.) 5 и консорциум микроорганизмов Рзеибошопаз ршйба 1 И, 1 ОИ, Р 5. шеШуПса 28 М и Кпобососсиз егушгороНз 5 Д, иммобилизованных на носителе из капроновых нитей и способных утилизировать сточные воды, содержащие формальдегид (6-8 ) и метанол ( 10-12 ), разведенные 1 10, 1 4 и 1 1 6. Однако при использовании данных способов требуется предварительная анаэробная очистка сточных вод с использованием микроорганизмов активного ила. Кроме того, не обнаружены микроорганизмы-деструкторь 1, способные утилизировать диметилфталат, орто-фталевую кислоту и метиловый спирт одновременно.Задачей предлагаемого изобретения является получение нового штамма, способного полностью разлагать диметилфталат (ДМФ), орто-фталевую кислоту и метанол в высоких концентрациях при локальной очистке содержащих эти вещества сточных вод.Для достижения поставленной задачи методом накопительной культуры из почвы, загрязненной пластификаторами в естественных условиях, получен штамм Р 5 еис 1 ошопа 5 ршйба БИМ В-318 Д (МК 55). Штамм депонирован в Научной коллекции типовых и промь 1 шленноценнь 1 х непатогенных микроорганизмов Института микробиологии Национальной академии наук Беларуси, где ему присвоен коллекционный номер БИМ В-318 Д.Штамм Рзеибошопаз рийба БИМ В-318 Д имеет следующие свойства.При росте на рыбно-пептонном агаре при 30 С через 1 сутки клетки исследуемого штамма представляют собой прямые или изогнутые укороченные палочки 0,4-0,81,04,0 мкм. Одиночные, в парах и коротких цепочках. Клетки подвижные, расположение жгутиков полюсное. Грамотрицательные.На среде ЬВ при 30 С клетки штамма МК 55 уже через 12 часов формировали изолированные колонии, на минимальной среде М 9 с ДМФ - на вторые сутки. Колонии округлые, с ровными краями, прозрачные, блестящие.Рост на плотных средахминеральная агаризованная среда М 9, г/лРост на жидких средахАэроб, мезофил, в факторах роста не нуждается. Способен расти при 5 С И не растет при 42 С.Синтезирует флуоресцирующий пигмент пиовердин, который иногда обнаруживается визуально по желто-зеленому окрашиванию среды, или по характерному свечению колоний и окружающей среды в УФ с длиной волны 260 нм.Обладает окислительным типом метаболизма глюкозы (тест Хью-Лейфсона), обнаруживает наличие оксидазной и аргининдигидрогеназной активностей.Растет, подкисляя Минеральную среду с глюкозой и Ь-арабинозой, но не с сахарозой,трегалозой, инозитом или сорбитолом в качестве единственного источника углерода. Леван не синтезирует, желатин не разжижает, нитраты не восстанавливает. Штамм потребляет ДМФ, ОФК и метанол в качестве единственного источника углерода и не требует стимуляторов деструкции сохраняет жизнеспособность и деструктивные свойства в течение 2 месяцев на МПА, МСА и агаризованной минеральной среде с ДМФ (0,5 ) или метанолом (О,1 ). Штамм Рзеидошопаз рийба БИМ В-318 Д не токсичен и не патогенен.Сущность предлагаемого изобретения поясняется следующими примерами вь 1 полнения.Посевной материал культуры Рзеибошопаз рийба БИМ В-318 Д выращивали в колбах Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл жидкой минеральной среды следующего состава(г/л) Ма 2 НРО 4 - 6, КН 2 РО 4 - 3, 11 аС 1 - 0,5, 1 ТН 4 С 1 - 1, М 5 О 4 - 0,5, СаС 12 - 1,0, ДМФ - 10,рН 7,3-7,5. Культуру вносили петлей с косяков, посевной материал инкубировали на качалке, обеспечивающей 180 об./мин при 29 С в течение 48 ч. Стеклянный биореактор объемом 1 л заполняли 50 г капронового волокна, 200 мл полученного посевного материала культуры Рзеибошопаз ршйба БИМ В-318 Д и жидкой минеральной средой вь 1 шеуказанного состава, добавляли ДМФ до конечной концентрации 10000,0 20000,0 и 50000,0 мг/л, рН доводили до 7,3-7,5. Процесс разрушения ДМФ вели при температуре 20 С и интенсивной аэрации (36 л/ч).Эффективность разрушения ДМФ в воде определяли по остаточному содержанию токсиканта до и после очистки. Содержание ДМФ контролировали методом ЯМРспектроскопии. Результаты спектроскопического анализа остаточного количества ДМФ,представленные в табл. 1, показывают, что культура Рзеибошопаз ршйба БИМ В-318 Д полностью разрушает токсикант в концентрации 10000,0 20000,0 и 50000,0 мг/л за 24, 72 и 264 ч соответственно.Таблица 1 Разрушение диметилфталата культурой Рзеиаошопаз рийаа БИМ В-318 ДПосевной материал культуры Рзеибошопаз рийба БИМ В-318 Д выращивали в колбах Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл жидкой минеральной среды следующего состава(г/л) Ыа 2 НРО 4 - 6, КН 2 РО 4 - 3, 1 ТаС 1 - 0,5, ЫН 4 С 1 - 1, М 35 О 4 - 0,5, СаС 12 - 1,0, ортофталевая кислота - 10, рН 7,3-7,5. Культуру вносили петлей с косяков, посевной материал инкубировали на качалке, обеспечивающей 180 об./мин при 29 С в течение 48 ч. Стеклянный биореактор, объемом 1 л заполняли 50 г капронового волокна, 200 мл полученного посевного материала культуры Рзеибошопаз рийба БИМ В-318 Д и жидкой минеральной средой вышеуказанного состава, добавляли, орто-фталевую кислоту до конечной концен 3трации 10000, 20000 И 50000 мг/л, рН доводили до 7,3-7,5. Процесс разрушения ОФК вели при температуре 20 С И интенсивной аэрации (36 л/ч).Эффективность разрушения ОФК в воде определяли по остаточному содержанию токсиканта до и после очистки. Содержание ОФК контролировали методом ЯМРспектроскопии. Результаты количества ОФК, представленные в табл. 2, показывают, что культура Рзеибошопаз рийба БИМ В-318 Д полностью разрушает токсикант в концентрации 10000,0 20000,0 и 50000,0 мг/л за 24, 48 и 72 ч соответственно.Таблица 2 Разрушение орто-фталевой кислоты культурой Рзеиаошопаз рийаа БИМ В-318 ДИсходное содержание Остаточное содержание ОФК, мг/лПосевной материал культуры Рзеибошопаз рийба БИМ В-318 Д вырашивали в колбах Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл жидкой минеральной среды следуюшего состава(г/л) Ыа 2 НРО 4 - 6, КН 2 РО 4- 3, 1 ТаС 1 - 0,5, МН 4 С 1 - 1, М 35 О 4 - 0,5, СаС 12 - 1,0, метанол - 10,рН 7,3-7,5. Культуру вносили петлей с косяков, посевной материал инкубировали на качалке, обеспечиваюшей 180 об./мин при 29 С в течение 72 ч. Стеклянный биореактор объемом 1 л заполняли 50 г капронового волокна, 200 мл полученного посевного материала культуры Рзеибошопаз рийба БИМ В-318 Д и жидкой минеральной средой вышеуказанного состава, добавляли метанол до конечной концентрации 5000, 10000 и 20000 мг/л,рН доводили до 7,3-7,5. Процесс разрушения метанола вели при температуре 20 С и интенсивной аэрации (36 л/ч).Эффективность разрушения метанола в воде определяли по остаточному содержанию токсиканта до и после очистки. Содержание метанола контролировали методом ЯМРспектроскопии. Результаты количества метанола, представленные в табл. 3, показывают,что культура Рзеибошопаз рийба БИМ В-318 Д полностью разрушает метанол в концентрации 5000,0 10000,0 и 20000,0 мг/л за 48, 72 и 168 ч соответственно.Таблица 3 Разрушение метанола культурой Рзеиаошопаз ритйаа БИМ В-318 ДНа основании проведенных исследований Рзеибошопаз ршйба БИМ В-318 Д предлагается использовать для локальной очистки сточных вод от диметилфталата и/или метанолаи орто-фталевой кислоты до поступления их в обший сток предприятия. Источники информации1. 511 ап 1 ег К, Кашашйзппа С., Зет Р.К. Веггабагйоп оГ зоше р 1 п 11 а 11 с асйб езгегз ш 5 о 11// Епуцоп. РоПш. - 1985. - Уо 1. А 39. - Не 1. Р. 1-7.