Штамм Rhodococcus opacus БИМ В-412Д – деструктор монохлорфенола

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Глушень Елена Михайловна Самсонова Алисса Самуиловна Семочкина Наталья Федоровна Филипшанова Людмила Ивановна Петрова Галина Михайловна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) ШтаммБИМ В-412 Д - деструктор монохлорфенола. Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для микробиологической очистки сточных вод и почвы от хлорированных фенолов. Цель изобретения - получение нового штамма, обладающего способностью к разложению повышенных концентраций широкого спектра хлорированных фенолов. Изобретение заключается в получении штаммаБИМ В-412 Д, деградирующего 2-хлор-, 3-хлор- и 4-хлорфенол. Штамм полностью разлагает монохлорфенолы в концентрации 100 мг/л, используя их в качестве единственного источника углерода. ШтаммБИМ В-412 Д выделен из почвы, подвергавшейся длительному загрязнению промвыбросами предприятия органического синтеза, депонирован в Республиканской коллекции микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси подБИМ В-412 Д. Известны штаммы микроорганизмов 1,. ВКПМ-1192, используемые для разложения фенола и его монохлорпроизводных в качестве единственных источников углерода и энергии 1-2. ИспользованиеВ-1205 для очистки стоков, содержащих в своем составе в суммарном количестве не более 100 мг/л различных фенольных и хлорфенольных соединений, позволяет достигнуть 70-98 степени очистки 3. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому изобретению является штамм актиномицетов-1284, выбранный в качестве прототипа, и деградирующий 2-хлорфенол в концентрации 50 мг/л,используя его в качестве единственного источника углерода 4. Недостатком прототипа является отсутствие у данного штамма способности использовать 3-хлорфенол и 4-хлорфенол, а также разрушать 2-хлорфенол в концентрациях выше 50 мг/л. 11112 1 2008.10.30 ШтаммБИМ В-412 Д имеет следующие свойства. Морфолого-культуральные свойства Грамположительные клетки образуют на ранней стадии развития рудиментарный мицелий, который в дальнейшем распадается на фрагменты, превращающиеся в результате ряда последовательных делений в палочки, а затем в кокки. Рост на плотных средах мясо-сусловый агар, 29 С, 3 суток штрих кремово-розовый, матовый, пастообразный колонии кремово-розовые, диаметром 1-5 мм, круглые, выпуклые, гладкие, сухие, легко снимаются с агара сусло-агар, 29 С, 5 суток штрих кремовый, матовый, пастообразный колонии кремовые, диаметром 1,5 мм, круглые, выпуклые, матовые, сухие, легко снимаются с агара минеральная агаризованная среда, г/л- 0,5 472 - 0,8 КН 2 РО 4 - 0,7 (4)24 - 1,5 агар-агар - 20,0 растительное масло - 1,0 рН 7,3-7,5 29 С, 14 суток штрих кремовый, матовый, пастообразный колонии кремовые, диаметром 1-3 мм, круглые, выпуклые, матовые, сухие, легко снимаются с агара. Рост на жидких средах мясо-пептонный бульон, 29 С, 7 суток характер роста - пленка, кремовый осадок жидкая минеральная среда, г/л- 0,5 472 - 0,8 24 - 0,7 (4)24 - 1,5 растительное масло 1,07,3-7,5 29 С, 14 суток характер роста - кремовый осадок, изменения среды не наблюдаются. Физиолого-биохимические свойства Аэроб, частично кислотоустойчив, оксидазоотрицателен, дает отрицательный тест Хью-Лейфсона с глюкозой, уреазо- и каталазоположителен. На среде МСА при 30 С формируют изолированные колонии через 18 часов. В клеточной стенке обнаружены галактоза, арабиноза, мезодиаминопимелиновая кислота (мезо-ДАПК), липид - ( тип). Образует кислоту из глюкозы, сахарозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, мальтозы, манита, сорбита и глицерина, но не из арабинозы, лактозы, рамнозы, дульцита. Усваивает натриевые соли органических кислот лимонной, пропионовой, бензойной,молочной, уксусной, но не щавелевой. Восстанавливает нитраты в нитриты, растет на нитритном агаре, на безазотистой среде Эжби, в присутствии 5, устойчив к тетрациклину (10 ед.) и бензилпенициллину (10 ед.). Штамм способен разлагать тирозин, не гидролизует крахмал, не разжижает желатин,не разлагает казеин, ксантин. Оптимальная температура роста -28 С. Оптимальные значения рН - 6,5-7,5. Штамм при росте на общепринятых средах и минеральной среде с растительным маслом не требует стимуляторов роста. Штамм использует растительное масло в качестве единственного источника углерода и не требует стимуляторов деструкции сохраняет жизнеспособность и деструктивные свойства в течение 6 месяцев на МПА, МСА и агаризованной минеральной среде с растительным маслом (0,1 ). ШтаммБИМ В-412 Д не токсичен и не патогенен. 11112 1 2008.10.30 Пример Для выделения и культивирования бактерий-деструкторов хлорфенолов использовали мясо-пептонный агар (МПА), мясо-сусловый агар (МСА), а также жидкие и агаризованные минеральные среды следующего состава (г/л) 12 (Е-8) КН 2 РО 4 - 1,0- 0,5 К 2 НР 4 - 1,0(3)42-0,001 дрожжевой экстракт - 0,5 рН 7,0-7,3. Хлорфенолы добавляли в среду в качестве единственного источника углерода после стерилизации в повышающемся от 50 до 200 мг/л количестве монохлорфенолов. Выделение микроорганизма, разрушающего ксенобиотики, проводили методом накопительных культур. Образцы помещали в жидкую минеральную среду с хлорфенолами в качестве единственного источника питания в концентрации 40 мг/л. Накопительные культуры получали путем 10-кратных пассажей в условиях повышающихся концентраций хлорфенолов в среде от 40 до 100 мг/л в течение 6 месяцев. Культуры накопления рассевались на поверхности агаризованной минеральной среды с хлорфенолами. Далее концентрацию хлорфенолов в селектирующей среде увеличивали от посева к посеву до 200 мг/л и получали штаммы с повышенной деструктивной активностью в отношении хлорфенолов. Способность выделенных микроорганизмов расти на хлорфенолах различного строения устанавливали ауксанографически на агаризованной минеральной среде с хлорфенолами. Чашки Петри с агаризованной средой засевали штрихом, результаты учитывали на 14-е сутки. Изучение трансформационной активности микроорганизмов-деструкторов монохлорфенолов проводили в колбах Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл жидкой минеральной среды в условиях интенсивной аэрации на качалке, обеспечивающей 180 об./мин., при 29 С. Рост бактериальных культур контролировали путем измерения оптической плотности культуральной жидкости на КФК-5 при 540 нм. Определение количества жизнеспособных клеток проводили на МПА и агаризованной минеральной среде Е-8 с добавлением хлорфенолов в количестве 20 мг/л, а массу сухих клеток - взвешиванием. Для качественного и количественного анализа галогенсодержащих соединений в КЖ использовали метод газожидкостной хроматографии на газовом хроматографе(ПИД и ДЭЗ). Определение проводили в надосадочной жидкости, полученной центрифугированием КЖ в течение 15 мин при 5 тыс. об./мин. При применении пламенно-ионизационного детектора (ПИД) использовали капиллярную колонку - длиной 30 метров, внутренним диаметром 0,32 мм, с нанесенной неподвижной фазой из полиэтиленгликоля толщиной 0,5 мкм. 3 11112 1 2008.10.30 При работе с детектором по электронному захвату (ДЭЗ) использовали капиллярную колонку НР-5 длиной 30 метров, внутренним диаметром 0,25 мм, с нанесенной неподвижной фазой из 5 бифенила и 95 диметил-полисилоксана толщиной 0,25 мкм. Анализ образцов проводили в режиме программирования температуры от 100 до 200 С с целью определения как более летучих интермедиатов биотрансформации, так и высококипящих соединений. Исследования проводили в следующих условиях температура испарителя - 275 С температура детектора - 300 С начальная температура в термостате в течение 5 минут 100 С нагрев до 200 С осуществляли со скоростью 10 С в минуту изотермического режима достигали в течение 20 минут расход газа-носителя при 100 С - 0,78 мл/мин, а коэффициент деления потока - 110 объем вводимой пробы - 0,8 мкл. Анализ динамики ростаБИМ В-412 Д в среде, содержащей монохлорфенолы в концентрации 200 мг/л, показал, что штамму в присутствии 4-ХФ характерна более высокая средняя удельная скорость по сравнению с ростом на 3-ХФ и 2-ХФ. Через 48 часов оптическая плотность культуральной жидкости, содержащей 2-ХФ, 3-ХФ и 4-ХФ, составляет 0,25 0,3 и 0,35, а средняя удельная скорость ростаБИМ В-412 Д - 0,121 0,124 и 0,144 ч-1 соответственно. Полное разрушение 2-ХФ, 3-ХФ и 4-ХФ осуществляется культурой .БИМ В 412 Д за 72, 48 и 24 часа соответственно (таблица 1). Таблица 1 Деградация монохлорфенолов в концентрации 100 мг/лБИМ В-412 Д Содержание монохлорфенолов,Хлорфенол 2 ХФ 3 ХФ 4 ХФ Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4