Способ диагностики функциональной активности клеточного звена иммунной системы при вирусном гепатите В, С или микст-гепатите B+С

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ В, С ИЛИ МИКСТ-ГЕПАТИТЕ С(71) Заявитель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Титов Леонид Петрович Тарасюк Владимир Васильевич Черношей Дмитрий Александрович Жмуровская Людмила Степановна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(56) ЧЕРНОШЕЙ Д.А. и др. Современные проблемы инфекционной патологии человека. Материалынаучно-практической конференции. - Мн. ФилСерв плюс, 2001. - С. 341-345.2743 1, 1999.4762, 1, 2002.(57) Способ диагностики функциональной активности клеточного звена иммунной системы при вирусном гепатите В, С или микст-гепатите ВС, включающий определение количества иммунокомпетентных клеток, экспрессирующих маркер адгезии 11 и маркеры активации 25 и -, путем их иммунофенотипирования, отличающийся тем, что дополнительно рассчитывают индексы активации 11/25, 11/и 25/- соответственно по отношению количества клеток, экспрессирующих 11, к количеству клеток, экспрессирующих 25, по отношению количества клеток,экспрессирующих 11, к количеству клеток, экспрессирующих -, и по отношению количества клеток, экспрессирующих 25, к количеству клеток, экспрессирующих-, и, если индекс активации 11/25 равен 1,040,3, индекс активации 11/- равен 0,940,18 и индекс активации 25/- равен 1,050,08,судят о нормальной функциональной активности клеточного звена иммунной системы, а если индексы активации 11/25 и 11/- имеют более высокие значения, а индекс активации 25/- - более низкое, судят о нарушении функциональной активности клеточного звена иммунной системы. Изобретение относится к области медицины, в частности к способам исследования иммунной системы, и может быть использовано для определения функциональной активности клеточного звена иммунной системы у больных вирусными гепатитами В (ВГВ), С(ВГС) и микст-гепатитом ВС (МГВС). Известен способ оценки функциональной активности Т-клеточного звена иммунной системы в реакции бласттрансформации лимфоцитов с митогенами путем забора крови из 11524 1 2009.02.28 периферической вены, выделения лимфоцитов, инкубации их в культуральной среде с добавлением митогенов (ФГА, Кон-А и др.) в СО 2-инкубаторе (37 С и 5,0 СО 2) и последующей оценкой пролиферативной активности лимфоцитов морфологическим способом или сцинтиляционным методом (применение радиоактивного раствора Н 3-тимидина) 1. Однако известный способ трудоемкий, требует работы в стерильных условиях и с радиоактивными изотопами, характеризуется низкой точностью и воспроизводимостью,длителен в исполнении, что делает его непригодным в клинической практике. Известен способ исследования Т-звена иммунитета путем постановки внутрикожных тестов с антигенами и/или митогенами, отражающих общую функциональную активность иммунокомпетентных клеток 2. Недостатками известного способа являются его трудоемкость, инвазивность, недостаточная информативность вследствие неполной дифференциации типа реагирования иммунной системы на используемые митогены и невысокая точность (субъективность полученных результатов). В качестве прототипа выбран способ диагностики функциональной активности клеточного звена иммунной системы, заключающийся в исследовании периферической крови и определении поверхностных рецепторов активации (25 (рецептора к ИЛ-2), - и др.) и адгезии (11) на клетках иммунной системы путем их иммунофенотипирования 3. Недостатком известного способа является то, что полученные отдельные морфологические (количественные) характеристики с трудом поддаются функциональной интерпретации и недостаточно информативны. Задачей настоящего изобретения является создание более эффективного способа, а именно повышение точности и информативности известного способа определения функциональной активности клеточного звена иммунной системы при ВГВ, ВГС и МГВС. Поставленная задача решается за счет того, что в способе диагностики функциональной активности клеточного звена иммунной системы при ВГВ, ВГС и МГВС, включающем определение количества иммунокомпетентных клеток, экспрессирующих маркер адгезии 11 и маркеры активации 25 и -, путем иммунофенотипирования,согласно изобретению, рассчитывают индексы активации 11/25, 11/- и 25/-, равные соответственно отношению количества клеток, экспрессирующих 11, к количеству клеток, экспрессирующих 25, отношению количества клеток,экспрессирующих 11, к количеству клеток, экспрессирующих -, и отношению количества клеток, экспрессирующих 25, к количеству клеток, экспрессирующих-, и если индекс активации 11/25 равен 1,040,3, индекс активации 11/- равен 0,940,18 и индекс активации 25/- равен 1,050,08,судят о нормальной функциональной активности клеточного звена иммунной системы, а если индексы активации 11/25 и 11/- имеют более высокие значения, а индекс активации 25/- - более низкое, судят о нарушении функциональной активации клеточного звена иммунной системы. Способ осуществляют следующим образом. Забирают кровь из периферической вены(5-6 мл) в пробирки с гепарином (20 ЕД/мл), выделяют мононуклеары периферической крови (МПК) методом градиентного центрифугирования или иммунофенотипирование проводят в цельной крови. Экспрессия 11, 25, - антигенов на МПК определяется в реакции иммунофлюоресценции с помощью соответствующих моноклональных антител согласно инструкции производителя. К 100 мкл МПК (1,0106/мл) или цельной крови добавляют 5-20 мкл соответствующего раствора моноклональных антител и инкубируют в течение 15-30 мин. Затем в случае с выделенными МПК проводят двойную отмывку фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и ресуспензируют в 300-500 мкл 1 раствора параформальдегида для фиксации. В случае с цельной кровью после взаимодействия с моноклональными антителами добавляют лизирующий раствор по 2 мл и инкубируют в темноте в течение 10 мин с последующей двойной отмывкой ФСБ и ресуспензированием 2 11524 1 2009.02.28 в 300-500 мкл 1 раствора параформальдегида. Учет реакции производится на проточном цитофлюориметре или микроскопическим методом с последующим определением относительного или абсолютного количества клеток, экспрессирующих изучаемые поверхностные антигены. Затем рассчитывают следующие индексы активации 1) отношение относительного или абсолютного количества клеток, экспрессирующих маркер адгезии (11), к относительному или абсолютному количеству клеток, экспрессирующих маркеры ранней(25) и поздней активации (-), - 11/25, 11/-, характеризующие степень функциональной активации клеточного звена иммунной системы 2) отношение относительного или абсолютного количества клеток, экспрессирующих маркер ранней активации (25), к относительному или абсолютному количеству клеток, экспрессирующих маркер поздней активации (-), - 25/-, характеризующий процессы ранней и поздней активации в качестве маркера состояния функционального резерва иммунокомпетентных клеток. Так, при значении соотношений 11/25 1,040,3 11/- - 0,940,18 и 25/- - 1,050,08 судят о нормальной функциональной активности клеточного звена иммунной системы (таблица). При повышении 11/25, 11/- и уменьшении 25/- - о нарушении функциональной активности клеточного звена иммунной системы, обусловленном наличием избыточной функциональной активности клеток иммунной системы и формированием состояния анергии за счет истощения функционального резерва иммунокомпетентных клеток. Индексы активации при ВГВ, ВГС и МГВС Индекс Контроль, Острый Хронический Острый Хронический 25 ВГВ,38 ВГВ,18 ВГС,38 ВГС,42 11/25 1,040,3 3,570,80 3,420,75 1,890,33 2,360,36 2,030,22 11/- 0,940,18 1,260,13 2,320,54 1,610,22 1,480,11 1,430,20 25/- 1,050,08 0,560,1 0,680,08 1,000,12 0,810,06 0,820,09 ПримечанияР 0,05 Р 0,1. Предложенный способ позволяет получить функциональные характеристики состояния клеточного звена иммунитета, свидетельствующие о функциональной готовности Т- и В-лимфоцитов к иммунному ответу или предрасположенности к состоянию анергии иммунокомпетентных клеток в последующем. У больных ВГС и МГВС индексы 11/25 и 11/- были увеличены по сравнению с таковыми в контрольной группе, что связано со значительным снижением функциональной активности клеточного звена иммунной системы. Снижение индекса 25/-, особенно у больных хроническим ВГС (Р 0,05), свидетельствует о снижении количества клеток, экспрессирующих ранние маркеры активации, и указывает на истощение функционального резерва иммунного ответа, что играет важную роль в формировании вирусспецифической анергии иммунной системы и неэффективности противовирусного ответа при вирусных гепатитах. Способ подтверждается примерами. 1. Больной Т., 41 год, история болезни 1462, дата госпитализации 20.04.2000. Хронический ВГС установлен в 1998 г., когда впервые были выявлены - . Поступил в инфекционную больницу для обследования и уточнения активности инфекционного процесса. Жалоб на момент осмотра не предъявлял. Результаты лабораторного обследования. БАК билирубин общ. - 24,4 (пр. - нет) мкмоль/л, АлАТ - 1,8 ммоль/ч/л, ТП - 9,2 ед.26.04.2000- 4,6109/л л - 39 , п - 8 , с - 45 , м - 6 , э - 2 , СОЭ - 8 мм/ч. 08.05.2000- 4,9 х 109/л л - 30 . 3 11524 1 2009.02.28 Установлен хронический ВГС (- ), клинико-биохимически минимальной степени активности. Фенотипическая характеристика иммунокомпетентных клеток проведена дважды с интервалом в 2 недели 26.04.2000 г. - 3 - 76,89(1,38109/л), 4 - 43,08(0,77109/л),8 - 46,88(0,84109/л), 11 - 26,92(0,48109/л), 16 - 34,38(0,62109/л),20 - 6,7(0,12109/л), 25 - 9,91(0,18109/л), 95 - 52,42(0,94109/л), - 20,0(0,36109/л) 08.05.2000 - 3 - 80,17(1,18109/л), 4 - 40,22(0,59109/л),8 - 26,54(0,39109/л), 11 - 14,0(0,21109/л), 16 - 10,07(0,15109/л),20 - 6,67(0,10109/л), 25 - 7,24(0,11109/л), 95 - 48,0(0,71109/л),- - 13,43(0,20109/л). Индексы активации свидетельствуют о нарушении активации клеточного звена иммунной системы за счет значительного снижения содержания СВ 25 -клеток при поступлении 11/25 - 2,72, 11/- - 1,35 и 25/-- 0,50 на 12-е сутки 11/25 - 1,93, 11/- - 1,04 и 25/- - 0,54, что указывает на нарушение механизмов активации и наличие истощения функционального резерва иммунокомпетентных клеток, способствующих формированию состояния анергии иммунной системы. 2. Больной М., 25 лет, история болезни 493, дата госпитализации 06.02.2000. Поступил в инфекционную больницу на 14-й день болезни с жалобами на боль в животе, тошноту, рвоту, желтуху на коже и видимых слизистых, холурию, ахолию. Установлен диагноз микст-гепатит острый ВГВ ( , -), желтушная среднетяжелая форма на фоне хронического ВГС (- ). Результаты лабораторного обследования. При поступлении БАК билирубин общий - 180,4 (пр. 96,4) мкмоль/л, АлАТ 42,0 ммоль/ч/л, ТП - 8,4 ед.- 8,5109 /л л - 24 , п - 9 , с - 51 , м - нет, э 5 , СОЭ - 2 мм/ч. Фенотипические параметры иммунокомпетентных клеток 3 - 61,02(1,24109/л),4 - 11,77(0,24109/л), 8 - 36,88(0,75109/л), 11 - 13,82(0,28109/л),16 - 31,85(0,65109/л), 20 - 9,23(0,19109/л), 25 - 4,55(0,09109/л),95 - 33,63(0,69109/л), - - 10,22(0,21109/л). Расчет индексов активации выявил нарушение активации иммунокомпетентных клеток за счет снижения экспрессии, в основном, маркера ранней активации 25 11/25 3,04, 11/- - 1,35 и 25/- - 0,45, что свидетельствует о формировании состояния анергии. После проведенного лечения (дезинтоксикационная терапиягепатопротекторы) в удовлетворительном состоянии больной выписан. При выписке БАК билирубин общ. - 31,9 (пр. - нет) мкмоль/л, АлАТ - 2,5 ммоль/ч/л,ТП - 2,2 ед.- 7,8109/л л - 51 , п - 4 , с - 34 , м - 5 , э - 3 , СОЭ - 4 мм/ч. Фенотипические параметры иммунокомпетентных клеток 3 - 58,14(2,31109/л),4 - 36,04(1,43109/л), 8 - 32,09(1,28109/л), 11 - 24,07(0,96109/л),16 - 30,03(1,20109/л), 20 - 15,56(0,62109/л), 25 - 7,41(0,29109/л),95 - 59,33(2,36109/л), - - 15,86(0,63109/л). Значения индексов активации практически не изменились (11/25 - 3,25,11/- - 1,52 и 25/- - 0,47), что свидетельствует о состоянии анергии,обусловленном нарушением процессов активации иммунокомпетентных клеток за счет функционального истощения клеточного звена иммунной системы на фоне, вероятно, активизации хронического ВГС после улучшения клинико-биохимических показателей острого ВГВ. Подтверждением этого являлось последующее диспансерное наблюдение за больным через 6 месяцев, которое выявило обострение хронического ВГС (-,, ДНК -, - , РНК). 11524 1 2009.02.28 Таким образом, предлагаемый способ диагностики функциональной активности Тсистемы иммунитета при ВГВ, ВГС и МГВС имеет значение для оценки функциональной активности клеточного звена иммунной системы и прогноза исхода заболевания, эффективности проводимой терапии. Рассчитываемые соотношения обладают более высокой информативностью в сравнении с обычными параметрами иммунной системы. Способ не требует больших материальных и временных затрат по сравнению с известным способом,прост в исполнении. Источники информации 1. Клиническая иммунология и аллергология Учебное пособие / Под ред. А.В.Караулова. - М. Медицинское информационное агентство, 2002. -С. 368. 2. Клиническая иммунология и аллергология Учебное пособие / Под ред. А.В.Караулова. - М. Медицинское информационное агентство, 2002. -С. 369. 3. Потапнев М., Буглова С., Смольникова В. Проточная цитометрия как метод диагностики патологических состояний человека // Инфекция и иммунитет Материалы Респ. науч.прак. конф. посв. 75-летию Бел НИИ ЭМ / МЗ Республики Беларусь, Бел НИИ ЭМ, Науч.техн. совет ГНТП Инфекционные заболевания. Бел. науч. общ. эпид., микр. и параз.,Бел. науч. общ. иммун., МГМИ, 1999. - С. 566. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5