Способ оценки состояния иммунной системы

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ(71) Заявитель Белорусский научно-исследовательский институт радиационной медицины МЗ РБ(73) Патентообладатель Белорусский научноисследовательский институт радиационной медицины МЗ РБ(57) Способ оценки состояния иммунной системы, включающий определение количества лимфоцитов, несущих специфические рецепторы к субстрату в реакции розеткообразования с частицами покрытыми субстратом, отличающийся тем, что лейкоциты периферической крови инкубируют с частицами, нагруженными рекомбинантным интерлейкином 2 и при получении значения розеткообразующих лимфоцитов среди общего их пула более 15, определяют активацию иммунной системы, а при значении 5 и менее - угнетение функции иммунной системы. Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано при оценке иммунного статуса человека. К числу показателей иммунного статуса относят количество лимфоцитов периферической крови, несущих на своей поверхности те или иные субстратсвязывающие структуры (антигены, рецепторы и др.) к некоторым биологическим веществам. В частности, важной характеристикой является уровень активированных лимфоцитов, т.е. экспрессирующих рецепторы к инсулину, к интерлейкину 2 (ИЛ 2), антигены и др. 1. Для определения специфических структур на поверхности клеток используют субстраты, меченые изотопом 4, флюоресцентным зондом, ферментом или частицами 1, 2, 3. Так, описан способ 1, при котором используется субстрат, связанный с частицами лимфоциты, несущие рецепторы к С 3 компоненту комплемента определяют методом розеткообразования с эритроцитами, покрытыми специфическим субстратом- С 3 компонентом комплемента 4. Наиболее близким решением, выбранным в качестве прототипа, является способ, при котором используют субстрат (рекомбинантный ИЛ 2, рИЛ 2), меченый изотопом (125) с последующей оценкой связывания радиомеченного субстрата (рИЛ 2) с клетками 4. Описанный способ имеет следующие недостатки 1) необходимы дорогостоящее оборудование (гамма-счетчик), реагенты и соответствующая лаборатория,1 2890 1 высококвалифицированный персонал, поэтому способ не применим в рутинной клинико-лабораторной практике 2) использование радиоактивных изотопов небезопасно и приводит к загрязнению окружающей среды 3) короткое время жизни (нестабильность) меченого изотопом субстрата Общими с прототипом признаками являются 1) объект исследования - лимфоциты периферической крови 2) принцип метода, основанный на специфическом связывании субстрата с рецептором 3) использование меченых реагентов. Задачей изобретения является упрощение техники проведения реакции и снижение ее стоимости. Поставленная задача достигается следующим образом. Заявляемый способ основан на взаимодействии меченого корпускулами субстрата (рИЛ 2) с рецепторами к интерлейкину 2. Для этого венозную кровь с антикоагулянтом (гепарин - 20 Ед/мл) отстаивают при 37 С, плазму со взвешенными лейкоцитами центрифугируют (150) в течение 5 минут. Супернатант отбрасывают, а осадок промывают 2,0 мл забуференного физиологического раствора (рН 7,4) при прежних условиях дважды и оценивают способность к розеткообразованию с частицами, несущими рИЛ 2. Диагностикум для определения лимфоцитов, несущих рецепторы к интерлейкину 2 готовят следующим образом эритроциты быка тщательно отмывают забуференным физиологическим раствором до исчезновения в супернатанте следов белка. 1 мл эритроцитов, упакованных центрифугированием (1000 об/мин., 15 мин.), смешивают с 2,5 раствором глютарового альдегида в общем объеме 20 мл. Инкубируют 24 часа при 4 С с периодическим встряхиванием и отмывают от глютарового альдегида. Препарат рИЛ 2 разводят в 1,0 мл дистиллированной воды и добавляют к осадку эритроцитов, после чего ресуспендируют и инкубируют 24 часа на холоду. Непрореагировавшие альдегидные группировки блокируют 0,1 раствором человеческого сывороточного альбумина. Хранят в осажденном состоянии в присутствии 0,1 азида натрия срок хранения препарата без потери активности - 6 месяцев. Число лимфоцитов в лейкосуспензии доводят до концентрации 2-3106 /мл диагностикум - до 50-75106 частиц/мл. В лунку планшеты для иммунологических исследований вносят по 100 мкл взвеси клеток и диагностикума, инкубируют 30 мин. при 37 С, после чего центрифугируют при 150. Супернатант удаляют,осадок ресуспендируют в 50 мкл 0,05 раствора глютарового альдегида. После высушивания и фиксации мазка этиловым спиртом, его прокрашивают азур-эозином. Используя увеличение 7 х 90 и масляную иммерсию, оценивают процент розеткообразующих клеток на 200 лимфоцитов. Пример 1. Больной Ж., 25 лет. Клинический диагноз хронический обструктивный бронхит, фаза обострения ДН 1. 20 мл венозной крови с гепарином (20 Ед/мл) отстаивают при 37 С, плазму со взвешенными лейкоцитами центрифугируют при 150 в течение 5 минут. Супернатант отбрасывают, осадок клеток промывают 2,0 мл забуференного физиологического раствора при прежних условиях дважды. Осадок разводят в 1,0 мл забуференного физиологического раствора (число лимфоцитов 3106 /мл) диагностикум для определения лимфоцитов, несущих рецепторы к интерлейкину 2 - приготовленный как описано выше - разводят до 75106 частиц/мл. В лунку планшеты для иммунологических исследований вносят по 100 мкл лейковзвеси и диагностикума, инкубируют 30 мин. при 37 С, после чего центрифугируют при 150. Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в 50 мкл 0,05 раствора глютарового альдегида. После высушивания и фиксации мазка этиловым спиртом, его прокрашивают азур-эозином. Используя увеличение 7 х 90 и масляную иммерсию,оценивают процент розеткообразующих клеток на 200 лимфоцитов он составил 25 , из чего выносят суждение об активации иммунной системы. Пример 2. Больной М., 35 лет. Клинический диагноз хронический остеомиелит. 20 мл венозной крови с гепарином (20 Ед/мл) отстаивают при 37 С, плазму со взвешенными лейкоцитами центрифугируют при 150 в течение 5 минут. Супернатант отбрасывают, осадок клеток промывают 2,0 мл забуференного физиологического раствора при прежних условиях дважды. Осадок разводят в 1,0 мл забуференного физиологического раствора (число лимфоцитов 2106 /мл) диагностикум для определения лимфоцитов, несущих рецепторы к интерлейкину 2 - приготовленный как описано выше - разводят до 50106 частиц/мл. В лунку планшеты для иммунологических исследований вносят по 100 мкл лейковзвеси и диагностикума, инкубируют 30 мин. при 37 С, после чего центрифугируют при 150. Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в 50 мкл 0,05 раствора глютарового альдегида. После высушивания и фиксации мазка этиловым спиртом, его прокрашивают азур-эозином. Используя увеличение 7 х 90 и масляную иммерсию,оценивают процент розеткообразующих клеток на 200 лимфоцитов он составил 5 , из чего выносят суждение об угнетении иммунной системы. Таким образом, предложенный способ позволяет оценивать состояние иммунной системы. Его преимущества перед традиционными 2890 1 1) упрощение техники выполнения реакции и, вследствие этого, ее доступность, что позволяет применять данный метод в качестве иммунных тестов 1 уровня 2) не используются радиоактивные изотопы 3) простота метода позволяет использовать его в качестве скринингового, при контроле эффективности иммуномодулирующей терапии. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.