Способ флуориметрического определения селена в биологических объектах и пищевых продуктах

(51)01 21/64 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕЛЕНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(72) Авторы Зайцев Виктор Александрович Соколов Сергей Михайлович Мойсеенок Андрей Георгиевич Бутько Зинаида Трофимовна Застенская Ирина Алексеевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(57) Способ флуориметрического определения селена в биологических объектах и пищевых продуктах, включающий мокрое сжигание органической части исследуемого образца,восстановление шестивалентного селена до четырехвалентного, образование комплекса селенистой кислоты и 2,3-диаминонафталина - 4,5-пиазоселенола и измерение интенсивности флуоресценции полученного комплекса, отличающийся тем, что мокрое сжигание органической части исследуемого образца осуществляют в аналитическом автоклаве смесью азотной кислоты и перекиси водорода, взятых в объемном соотношении 20,5, под давлением 5-10 МПа в течение 1-2 часов. Изобретение относится к медицинской химии, биохимии, в частности к способам контроля содержания селена в биологических объектах, пищевых продуктах и предназначено для лабораторных служб госэпиднадзора и других медицинских учреждений, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также исследующих обеспеченность организма человека важнейшим незаменимым микроэлементом селеном. Известен способ определения селена в продуктах питания 1, сущность которого заключается в осуществлении мокрого сжигания образца смесью азотной и хлорной кислот,восстановлении шестивалентного селена до четырехвалентного действием соляной кислоты и образование между селенистой кислотой и 2,3-диаминонафталином (ДАН) комплекса 4,5-пиазоселенола, величина флуоресценции которого пропорциональна содержанию селена в пробе. 8202 1 2006.06.30 Указанный способ является аналогом по отношению к заявляемому. Общими признаками для заявляемого способа и аналога являются мокрое сжигание образца, восстановление шестивалентного селена до четырехвалентного, образование между селенистой кислотой и 2,3-диаминонафталином комплекса 4,5-пиазоселенола и флуориметрирование указанного комплекса. Однако способ-аналог обладает следующими недостатками. Мокрое сжигание образца осуществляют смесью азотной и хлорной кислот и проводят в алюминиевом блоке сжигания в пробирках с притертыми пробками высотой 12 см. Полное окисление органической части образца достигается в течение 3,5 часов. Учитывая многообразие существующих в природе соединений селена, различающихся химической и термической устойчивостью, а также высокой их летучестью, проведение стадии мокрого сжигания в открытых системах в течение 3,5 часов приводит к потере микроэлемента селена на данной стадии процесса, а, следовательно, и понижению точности определяемого компонента. Наиболее близким к заявляемому является способ определения селена в биологических жидкостях и пищевых продуктах, включающий мокрое сжигание органической части образца, восстановление шестивалентного селена до четырехвалентного, образование между селенистой кислотой и 2,3-диаминонафталином комплекса 4,5-пиазоселенола и флуориметрирование указанного комплекса 2. Мокрое сжигание органической части образца ведут также в алюминиевых блоках в открытых пробирках. В качестве окисляющих агентов используют сильную окисляющую смесь азотной и хлорной кислот, соотношение которых варьируют в зависимости от навески и природы анализируемого объекта. Полное окисление исследуемого объекта достигается аналогично, как и в предыдущем способе, в течение 3,5 часов. Для отделения мешающих определению селена ионов железа в способеаналоге используют динатриевую соль этилендиаминтетрауксуной кислоты (ЕДТА), в то время как в данном способе применяют гидроксиламин солянокислый раствор ЕДТА, который одновременно восстанавливаетдо, что предотвращает влияние железа, а также последующее окисление ДАН в реакции конденсации. В качестве экстрагирующего агента при приготовлении ДАН в данном способе используют циклогексан, что обеспечивает более эффективную очистку 2,3-диаминонафталина и удлиняет срок хранения данного реагента до 7-10 дней. В способе-аналоге для очистки ДАН применяется гексан, и раствор ДАН готовят в день проведения анализа. Указанный способ 2 является прототипом по отношению к заявляемому. Общими признаками для заявляемого способа и прототипа является мокрое сжигание органической части образца, удаление следов азотной кислоты, восстановление шестивалентного селена до четырехвалентного, образование между селенистой кислотой и 2,3 диаминонафталином комплекса 4,5-пиазоселенола и последующее флуориметрирование указанного комплекса. Для отделения мешающих ионов железа и предотвращения окисления ДАН в реакции конденсации используют гидроксиламин солянокислый раствор ЕДТА, а в качестве экстрагирующей смеси комплекса 4,5-пиазоселенола применяют циклогексан. Однако указанный способ-прототип обладает следующими недостатками. Мокрое сжигание исследуемого образца осуществляется в алюминиевых блоках сжигания в пробирках, полное окисление органической части образца достигается в течение 3,5 часов. Проведение стадии мокрого сжигания в открытой системе, а также длительность процесса окисления приводит к потере микроэлемента на данной стадии, и, соответственно, низкой точности полученных результатов. Задачей заявляемого способа является повышение точности и сокращение времени определения селена в биологических объектах и пищевых продуктах. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ флуориметрического определения селена в биологических объектах и пищевых продуктах, включающий мокрое сжигание органической части исследуе 2 8202 1 2006.06.30 мого образца, восстановление шестивалентного селена до четырехвалентного, образование комплекса селенистой кислоты и 2,3-диаминонафталина - 4,5-пиазоселенола и измерение интенсивности флуоресценции полученного комплекса, при этом мокрое сжигание органической части исследуемого образца осуществляют в аналитическом автоклаве смесью азотной кислоты и перекиси водорода, взятых в объемном соотношении 20,5, под давлением 5-10 Мпа в течение 1-2 часов. Автоклав аналитический представляет собой герметизируемую в титановом кожухе фторопластовую реакционную камеру, в которой исследуемые вещества подвергаются обработке реактивами под воздействием температуры и давления. В герметично закрытой реакционной камере (химическом реакторе) за счет высокого давления и нагрева исследуемого образца и реактивов до температур, в несколько раз превышающих температуру кипения реактивов в открытых системах, улучшаются условия разложения образца и увеличивается скорость химической реакции. Это обеспечивает полноту окисления органической части образца и сокращает время минерализации исследуемого продукта. Потери микроэлемента селена на стадии мокрого сжигания сводятся к минимуму, что приводит к повышению точности, а также сокращению времени определения селена в исследуемых системах. Кроме того, исключается применение взрывоопасной хлорной кислоты. Результаты определения селена заявляемым способом и согласно прототипу приведены в табл. 1-3. Содержание селена в исследуемых образцах определяют используя в каждой серии определений референс-стандарты. Результаты определений хорошо соответствуют регламентированным значениям. Пример 1. Определение селена в сыворотке крови жителей Беларуси. Взвешивают и переносят во фторопластовую реакционную камеру для сжигания от 50 до 100 мг (в зависимости от содержания селена) исследуемого продукта и соответствующего образца сравнения. Дальнейшие исследования проводят аналогично, как и при построении калибровочной кривой. Построение калибровочной кривой 1. Мокрое сжигание. Для построения калибровочной кривой в 6 реакционных камер вносят по 3 см 3 стандартных рабочих растворов селенистокислого натрия, что соответствует 0 5 10 20 30 40 нг селена в пробе. Во все реакционные камеры добавляют по 3-7 см 3 концентрированной азотной кислоты, 0,75-1,5 см 3 перекиси водорода и оставляют при комнатной температуре на 10-12 часов. Затем реакционные камеры вставляют в герметизируемый титановый кожух, помещают в аналитический автоклав и осуществляют минерализацию в температурном режиме 160 С в течение 1 часа. Анализируемые образцы после автоклавной минерализации охлаждают и количественно переносят в мерные пробирки. Для удаления следов азотной кислоты в пробы добавляют по 1-2 капли перекиси водорода и кипятят в течение 10 минут. 2. Восстановление шестивалентного селена до селена четырехвалентного. К пробам добавляют по 1 см 3 6 М соляной кислоты и выдерживают при Т 110 С в течение 10 минут. Охлаждают, добавляют 1,0 см 3 25 муравьиной кислоты и перемешивают. На этой стадии процесс можно оставить до следующего дня, так как образующиеся соединения селена не являются летучими. 3. Образование комплекса 4,5-пиазоселенола между селенистой кислотой и 2,3 диаминонафталином и его флуориметрическое определение. В каждую пробирку добавляют по 1,0 см 3 гидроксиламин солянокислого раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты и по 1,0 см 3 раствора аммиака. Устанавливают рН проб до 1,5-2,0, корректируя его 4 М раствором соляной кислоты. К полученным растворам добавляют по 1,0 см 3 заранее приготовленного раствора 2,3 диаминонафталина и выдерживают 30 минут при 50 С без попадания прямого света. 3 8202 1 2006.06.30 По окончании процесса пробы охлаждают до комнатной температуры и каждую интенсивно экстрагируют 2,5 см 3 циклогексана в течение одной минуты. На спектрофлуориметре измеряют величину флуоресценции органического экстракта (в течение 2 часов) при длине волны 369 нм и эмиссии 518 нм. 4. Обработка результатов. На основании полученных данных строят калибровочную кривую зависимости флуоресценции от количества селена в пробе. Массовую долю селенав мкг/кг (мкг/дм 3) продукта вычисляют по формуле ХВ/а,где В - массовая доля селена в пробе, определенная по калибровочной кривой а - масса навески образца, взятого на анализ, г или для жидких продуктов объем образца, взятого на анализ, см 3. За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение двух определений. Относительное стандартное отклонение в интервале от 1 до 600 мкг/кг - 10 . Полученные данные по определению селена в сыворотке крови приведены в табл. 1. Таблица 1 Содержание селена, Относительная Время Способ исследования мкг/л ошибка,минерализации, часы,Заявляемый способ 59,1 4,8 1,0 53,8 4,6 Прототип 46,2 8,05 3,5 54,3 7,46 Пример 2. Определение селена в волосах жителей Беларуси. Определение селена в волосах ведем аналогично определению селена в сыворотке крови (табл. 2). Таблица 2 Содержание селена, Относительная Время Способ исследования мкг/кг ошибка,минерализации, часы Заявляемый способ 456 3,4 1,0 487 3,28 Прототип 425 7,9 3,5 498 7,4 Пример 3. Определение селена в куриных яйцах. Взвешивают и переносят во фторопластовую реакционную камеру для сжигания от 0,5 до 1,0 г (в зависимости от содержания селена в продукте) исследуемого продукта и соответствующего образца сравнения. 1. Мокрое сжигание. Во все реакционные камеры добавляют по 3-5 см 3 (в зависимости от навески и содержания селена в пробе) концентрированной азотной кислоты и 0,5-1,0 см 3 перекиси водорода и оставляют при комнатной температуре на 10-12 часов. Затем реакционные камеры вставляют в герметизируемый титановый кожух, помещают в аналитический автоклав и осуществляют минерализацию в температурном режиме 160 С в течение 1 часа и 1 час при Т 180 С. Анализируемые образцы после автоклавной минерализации охлаждают и количественно переносят в мерные колбы. Отбирают аликвотное количество пробы, в которой содержание селена составляло бы 10-30 нг, добавляют по 1-2 капли перекиси водорода и кипятят в течение 10 минут для удаления следов азотной кислоты. Дальнейшие исследования осуществляют так, как и при построении калибровочной кривой. 4 8202 1 2006.06.30 2. Обработка результатов. Массовую долю селенав мкг/кг (мкг/дм 3) продукта вычисляют по формуле ХВ/а, С где В - массовая доля селена в пробе, определенная по калибровочной кривой а - масса образца, содержащаяся в аликвоте, взятой на анализ, или для жидких продуктов объем образца, взятого на анализ, см 3. С - масса навески образца, взятого на анализ, г, или для жидких продуктов объем образца, взятого на анализ, см 3. За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение двух определений. Относительное стандартное отклонение в интервале от 1 до 600 мкг/кг - 10 . Результаты определения селена в яйцах куриных приведены в табл. 3. Таблица 3 Содержание селена,Относительная Время Метод исследований мкг/кг ошибка,минерализации, часы Заявляемый способ 213 3,8 2,0 197,4 3,8 Прототип 154,3 6,3 3,5 146,2 6,3 Таким образом, по сравнению с прототипом, заявляемый способ обладает следующими преимуществами повышает точность определения микроэлемента селена в биологических объектах на 30-35 , сокращает время минерализации органической части образца на 1,5-2,5 часа, а также исключает применение взрывоопасной хлорной кислоты. Использование данного способа дает возможность выбора вариаций в аппаратурном оформлении и выборе реагентов. Это открывает возможности применения способа для определения содержания микроэлемента селена в пищевых продуктах, биологических средах, организме человека, что необходимо для исследования обеспеченности организма микроэлементом селеном, а также для диагностики и лечения целого ряда заболеваний,связанных с нарушениями антиоксидантной защитной системы организма. Источники информации 1. Методы контроля. Химические факторы. Определение селена в продуктах питания Методические указания. МУК 4.1.033-95. - Москва. 1995 (аналог). 2.. // . . . - 1984. - . 165.1. - . 187-194 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5