Способ лечения инсулинзависимого сахарного диабета

СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИНСУЛИНЗАВИСИМОГ О САХАРНОГО ДИАБЕТА(71) Заявитель Учреждение образования Белорусский государственный медицинский университет (ВУ)(72) Авторы Горанов Виталий Анатольевич Прохоров Александр Викторович Третьяк Станислав Иванович (ВУ)(73) Патентообладатель Учреждение образования Белорусский государственный медицинский университет (ВУ)Шумаков В.И. и др. Трансплантация островковых клеток поджелудочнойСпособ лечения инсулинзависимого сахарного диабета, включающий пересадку трансплантата островковых клеток поджелудочной железы, отличающийся тем, что пересадку трансплантата проводят в сосудистое русло, при этом используют островковые клетки, которые при культивировании подвергают температурной адаптации путем постепенного в течение 5 суток снижения температуры до 24 С, а затем постепенного в течение 5 суток ее подъема до 37 С в условиях обогащения атмосферы азотом на 10 об. .ИЗОбрЕТЕНИЕ ОТНОСИТСЯ К МЕДИЦИНЕ, К разделу трансплантологии, а ИМЕННО К ЛЕЧЕНИЮ инсулинозависимой фОрМЫ сахарного диабета, связанной С недостаточностью фУНКЦИЙ ОСТрОВКОВЫХ КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.ИЗВЕСТЕН СПОСОб ЛЕЧЕНИЯ сахарного диабета С ПОМОЩЬЮ пересадки ОСТрОВКОВЫХ КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В СВОбОДНОМ СОСТОЯНИИ И имплантации МИЛЛИПОрОВЫХ каМЕр, содержащих микрофрагменты ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ ПЛОДНОЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. Однако ПрИ данном СПОСОбЕ КЛИНИЧЕСКИЙ ЭффЕКТ кратковременен В СВЯЗИ С ОТТОрЖЕНИЕМ И СНИЖЕНИЕМ функциональных СПОСОбНОСТЕЙ трансплантированных КЛЕТОКИЗВЕСТЕН СПОСОб ЛЕЧЕНИЯ сахарного диабета С ПОМОЩЬЮ пересадки ОСТрОВКОВЫХ КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПОДКОЖНУЪО клетчатку, ПрИ КОТОрОМ ПрОВОДЯТ ПОДГОТОВКУ КУЛЬТУРЫ ОСТрОВКОВЫХ КЛЕТОК К трансплантации ПУТЕМ обогащения СУСПЕНЗИИ ОСТрОВКОВЫХ КЛЕТОК коллагеном И эндотелиоцитами (ДЛЯ формирования ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ СОСУДИСТОЙ СЕТИ). В данном СПОСОбЕ достигается развитие ИНТЕНСИВНО васкуляризируемого И В рЯДЕ случаев трансплантации ЖИВОТНЫМ - ЖИЗНЕСПОСОбНОГО конгломерата КЛЕТОКУказанный СПОСОб ЯВЛЯЕТСЯ ПрОТОТИПОМ ПО ОТНОШЕНИЮ К заявляемому. ОбЩИМ ПрИзнаком ДЛЯ заявляемого способа И прототипа ЯВЛЯЕТСЯ ПОВЫШЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОбНОСТИ функционально-затребованных КЛЕТОК (ОСТрОВКОВЫХ) за СЧЕТ минимизации барьера (ЭНДОТЕЛИЙ) МЕЖДУ КрОВЬЮ И трансплантированными клетками.Однако указанный прототип обладает следующими недостаткамиПодвергается отторжению в течение короткого периода (1 неделя) за счет действия растворимых иммунных комплексов и молекул комплемента.Происходит гибель большого количества инсулинпродуцирующих клеток в ходе манипуляций, связанных с перемещением трансплантата в организм реципиента.Задача данного изобретения - повышение жизнеспособности клеточного трансплантата, профилактика отторжения культуры островковых клеток поджелудочной железы при трансплантации в сосудистое русло.Поставленная задача достигается предложенным способом лечения сахарного диабета путем пересадки клеточного трансплантата островковых клеток поджелудочной железы в сосудистое русло и включает проведение предварительной адаптации клеточного трансплантата путем формирования дополнительного кластера в культуре с помощью инкубации части клеток в условиях атмосферы азота ( 10 об ) и одновременном понижении температуры инкубации до 24 С.При этом достигается получение устойчивых клеток, находящихся в состоянии медленного вызревания, которые обеспечивают поддержание пула, необходимого для восстановления трансплантата после стресса, связанного с перемещением культуры в организм реципиента, одновременно с присутствием достаточного количества активных инсулинпродуцирующих клеток (необработанный кластер).Способ осуществляется следующим образом.Выделяют Б-клетки из поджелудочных желез новорожденных кроликов, ткань сразу помещают в среду КРМ 11640 и выдерживают до следующего этапа при температуре 48 С. Иссечение желез проводят в растворе, обладающем цитопротекторным эффектом, до фрагментов размером 0,1-0,5 мм. После промывания средой с антибиотиком полученные фрагменты обрабатывают 15 -ным раствором коллагеназы (Зйша) на физиологическом растворе и инкубируют при температуре 37 С при периодическом встряхивании (первая фракция). Полученную суспензию отмывали стерильной средой КРМ 11640 дважды и переносили для дальнейшей сепарации в градиент стерильного перкола. Дальнейшее разделение клеток производят на перколе путем центрифугирования при 12006. Клетки собирают на градиенте перкола, отмывают с физиологическим раствором, доводят до конечной концентрации 450-550 тыс. клеток/мл с помощью соответствующего количества среды КРМ 11640 с 10 эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и помещают в культуральные пластиковые флаконы с ростовой средой, которые затем помещают в СО 2 инкубатор (5 СО 2) и инкубируют при 37 С. Начиная с 7 суток, четыре флакона подвергают температурной адаптации при медленном снижении температуры культивирования до 24 С в течение 5 суток и дальнейшим постепенным ее подъемом до 37 С в условиях обогащения атмосферы азотом ( 10 об. ).Полученную клеточную суспензию трансплантируют в сосудистое русло животного со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом.При этом у животных происходит значительное снижение потребности в экзогенном инсулине. Предтрансплантационный уровень потребности в экзогенном инсулине у собак с 1-й серией культур клеток восстанавливается к 112 1 20 дню, со 2-й серией - к 34 1 14 дню. Таким образом, адаптированная комплексным воздействием культура обладает более высокой жизнеспособностью в условиях 111 уйуо 110 сравнению с неадаптированной.Таким образом по сравнению с прототипом указанный способ обладает следующими преимуществами1. Обеспечивает высокую жизнеспособность и функциональную активность адаптированного клеточного трансплантата в условиях 111 уйуо и 1 п уйгго.2. Замедление метаболизма И пролиферации КлетоК, позволяющее на фоне постепенного созревания добиться снижения их чувствительности К повреждающим воздействиям.3. Снижение рецепторной чувствительности КлетоК К воздействию повреждающих агентов, в том числе антител, Комплемента и др.Было проведено исследование влияния адаптации К низКой температуре (24 С) в условиях атмосферы азота (10 об ) на выживаемость и фунКциональную аКтивность Б-КлетоК в Культуре, что позволяло вызвать временное снижение метаболизма В-КлетоК.Кроличьи Б-КлетКи были выделены преимущественно по методиКе М 151 ег е а 1. с частичной модифиКацией по ШумаКову. Сразу после получения поджелудочных желез новорожденных КролиКов тКань помещали в среду КРМ 11640 и выдерживали до следующего этапа при температуре 4-8 С. Иссечение желез проводилось в растворе, обладающем цитопротеКторнь 1 м эффеКтом, до фрагментов размером 0,1-0,5 мм. После промывания средой с антибиотиКом полученные фрагменты обрабатывали 15 -ным раствором Коллагеназы (Зйша) на физиологичесКом растворе и инКубировали при температуре 37 С при периодичесКом встряхивании (первая фраКция). В том случае, если на дне оставались несепарированные фрагменты, их повторно сепарировали с помощью 15 раствора Коллагеназь 1 в течение 40 мин при температуре 37 С. Полученную суспензию отмывали стерильной средой КРМ 11640 дважды и переносили для дальнейщей сепарации в градиент стерильного перКола. Дальнейщее разделение КлетоК производят на перКоле путем центрифугирования при 12006. КлетКи собирали на градиенте перКола, отмывали с физиологичесКим раствором, доводили до Конечной Концентрации 450-550 тыс. КлетоК/мл с помощью соответствующего Количества среды КРМ 11640 с 10 эмбриональной сь 1 воротКи Крупного рогатого сКота и помещали в Культуральные пластиКовые флаКоны с ростовой средой, Которые затем помещают в СО 2-инКубатор (5 СО 2), и инКубировали при 37 С. Начиная с 7 сутоК, четыре флаКона подверглись температурной адаптации при медленном снижении температуры Культивирования до 24 С в течение 5 сутоК с дальнейщим постепенным ее подъемом до 37 С за то же время в условиях обогащения атмосферы азотом ( 10 об. ) (1 эКспериментальная серия). Другие 4 флаКона с Клеточным материалом продолжали содержаться при температуре 37 С (П эКспериментальная серия) и таКой же Кратностью смены среды (1 раз в двое сутоК). По оКончании эКсперимента, то есть через 25 дней, были подведены итоги по фунКциональной аКтивности тестируемых Культур.Для оценКи уровня фунКционирования полученной Культуры эмбриональных островКовь 1 х КлетоК определяли аКтивность инсулина в Культуральной среде иммуноферментнь 1 м методом.На 7 день нестимулированная аКтивность инсулина в Культуральной жидКости в обеих сериях эКсперимента составляла 47,6 1 2,8 мКЕД/мл. На 16 сутКи Культивирования аКтивность инсулина в Культуральной жидКости П серии составила 39,1 1 1,7 мКЕД/мл, для 1 серии то же значение составляет 34,4 1 3,1 мКЕД/мл. На 25 день эКсперимента аКтивность в 1 серии составила 31,3 1 0,9 мКЕД/мл, для П серии аКтивность составила всего 18,4 1 3,7 мКЕД/мл. Данные результаты свидетельствуют о почти двуКратном падении вь 1 работКи инсулина К 25 дню эКсперимента КлетКами, не подвергшимися температурной адаптации по отнощению К Контролю. Это подтверждает более высоКие жизненные потенции Б-КлетоК, Которые после манипуляции оКазываются лучще адаптированными и более фунКционально аКтивными в условиях 111 что. В дальнейщем оценивали жизнеспособность и фунКциональную аКтивность адаптированных Б-КлетоК в условиях ш уйуо.ОбъеКтом исследования являлись беспородные собаКи массой 10-12 Килограммов.Использовали 2 эКспериментальные серии Культур Б-КлетоК (1 - адаптированная, 2 Контрольная), приготовленных по описываемой выще методиКе. Клеточную суспензию заКлючали в полупроницаемые Контейнеры из полиамида (500000/Контейнер) с диаметром пор 1 мКм и трансплантировали собаКам со стрептозотоцин-индуцированнь 1 м сахарнымдиабетом в сосудистое русло. У всех животных произошло значительное снижение потребности в экзогенном инсулине. Предтрансплантационнь 1 й уровень потребности в экзогенном инсулине у собак с 1-й серией культур клеток восстановился К 112 1 20 дню, со 2-й серией - К 34 1 14 дню. Таким образом, адаптированная комплексным воздействием культура обладала более высокой жизнеспособностью в условиях 1 п уйуо по сравнению с неадаптированной.Таким образом, по сравнению с прототипом указанный способ обладает следующими преимуществами1. Высокая жизнеспособность и функциональная активность адаптированного клеточного трансплантата в условиях 111 уйуо и 111 уйгго.2. Простота выполнения заявляемого способа.Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.