Способ выделения фосфолипазы А2

(51)12 9/16 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ А 2(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Автор Литвинко Наталья Михайловна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Способ выделения фосфолипазы А 2 из поджелудочной железы свиньи, включающий первичную обработку исходного сырья путем гомогенизации, автолиза и центрифугирования гомогената с последующими обработкой надосадочной жидкости сульфатом аммония, отделением осадка, растворением его в воде при нагревании, смешивание полученного водного раствора с раствором лецитина в толуоле при 4,6-4,8, экстракцию целевого продукта из органической фазы слабощелочным водным раствором и его хроматографию на биогеле, а затем на карбоксиметилцеллюлозе. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экстракцию проводят раствором бикарбоната аммония при 7,8-8,0. Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу выделения фермента фосфолипазы А 2, который находит применение для получения биоактивных продуктов гидролиза - лизофосфолипидов и жирных кислот. Фосфолипаза А 2 (далее ФЛ А 2) осуществляет гидролиз сложноэфирной связи во втором положении глицеринового скелета молекулы фосфоглицеридов, и благодаря этому изменение активности ФЛ А 2 может служить критерием при диагностике таких болезней человека, как ишемия миокарда, гипоксия, воспалительные процессы, аллергия, тромбообразование, отеки при радиационном поражении и др. Процесс выделения ФЛ А 2 в активном состоянии из биологических объектов, которыми являются ткани и биологические жидкости человека и животных, весьма трудоемок и многостадиен 1. Известен (прототип) способ выделения фосфолипазы А 2 из поджелудочной железы свиньи, включающий предварительную обработку поджелудочной железы свиньи с по 8416 1 2006.08.30 следующим промыванием после центрифугирования осадка насыщенным раствором сульфата аммония 2. Однако целевой продукт выделяется в виде трудноразделимого комплекса фермента с фрагментами денатурированной ДНК, который обладает несвойственными для гомогенного белка характеристиками. Задачей настоящего изобретения является разработка препаративного способа выделения фермента фосфолипазы А 2 из биологического сырья с сохранением его каталитических свойств. Поставленная задача решается предлагаемым способом выделения фосфолипазы А 2 из поджелудочной железы свиньи путем аффинной сорбции ФЛ А 2 на летицине, находящемся в растворе толуола. Заявляемый способ заключается в первичной обработке поджелудочной железы свиньи путем гомогенизации, автолиза и центрифугирования гомогената с последующими обработкой надосадочной жидкости сульфатом аммония, отделением осадка, растворением его в воде при нагревании, смешивании полученного водного раствора с раствором лецитина в толуоле при 4,6-4,8, экстракции целевого продукта из органической фазы слабощелочным водным раствором и его хроматографии на биогеле, а затем на карбоксиметилцеллюлозе, экстракцию проводят раствором бикарбоната аммония при 7,8-8,0. Лецитин является специфическим субстратом ФЛ А 2, активность которой проявляется только в присутствии ионов кальция. Однако в связи с тем, что образование ферментсубстратного комплекса происходит и в отсутствие этого кофактора, появляется возможность использовать субстрат, помещенный в не смешивающийся с водой органический растворитель, в качестве жидкофазного сорбента для экстракции ФЛ А 2 из смесей. Чтобы исключить взаимодействие между ФЛ А 2 и нуклеиновой кислотой, сорбцию фермента на субстрате проводили предпочтительно при 4,7. Таким образом, разработан метод выделения ФЛ А 2 из гомогената поджелудочной железы путем сорбции на лецитине в отсутствие кофактора с использованием сродства фермента к субстрату и гидрофобных свойств субстрата, благодаря которым, будучи помещенным в не смешивающийся с водой органический растворитель, он может выступать в качестве жидкофазного сорбента. Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения, не ограничивающими объема изобретения. Пример 1 1. Первичная обработка исходного материала. Поджелудочную железу свиньи хранят 2 недели при температуре -15 С для увеличения исходной активности фермента, затем обезжиривают механическим способом. 1000 г железы измельчают при помощи мясорубки и гомогенизируют по частям с 3000 мл раствора 0,15 М хлористого натрия, предварительно охлажденного до температуры 4 С в микроразмельчителе тканей типа РТ-2. Гомогенат подвергают автолизу в присутствии 30 мг трипсина в течение 18 час при температуре 4 С. Гомогенат центрифугируют 30 мин при 4000 об/мин при температуре 0 С на центрифуге-70 с использованием углового ротора. Надосадочную жидкость обрабатывают порошком сухого сульфата аммония до тех пор, пока не достигалось 40 насыщения. Смесь взбалтывают на качалке в течение 1 час с последующим центрифугированием 30 мин при 4000 об/мин и температуре 0 С на центрифуге-70. Надосадочную жидкость обрабатывают порошком сухого сульфата аммония до тех пор, пока не достигалось 70 насыщения, после чего смесь снова взбалтывают на качалке в течение 1 час с последующим центрифугированием на центрифугеК-23 в течение 50 мин при 6000 об/мин, температуре 0 С. Полученный осадок (УФ-спектр растворенного в 0,75 Мосадка имел максимум при 270 нм и ми 2 8416 1 2006.08.30 нимум при 253 нм, Емакс/Емин 1,05) промывают насыщенным раствором сульфата аммония. При этом УФ-спектр промывной жидкости после трех промываний имел максимум при 260 нм и минимум при 235 нм, а осадок, растворенный в 0,75 М , имел УФ-спектр с максимумом при 278 нм и минимумом при 253 нм. Осадок, полученный после промывания тремя литрами насыщенного раствора сульфата аммония (70 ),растворяют в 1 л дистиллированной воды (УФ-спектр имел максимум при 278 нм и минимум при 253 нм, Емакс/Емин 1,6) и проводят термообработку в течение 10 мин в термостате после достижения 70 С,4,0. Далее раствор охлаждают и хранят при 4 С в течение 20 час, полученный осадок отделяют на бумажном фильтре, а надосадочную жидкость помещают упариваться над щелочью, после чего подвергают лиофилизации. 2. Сорбция ФЛ А 2 на лецитине, находящемся в толуоле. Раствор лиофилизованного порошка, полученного из поджелудочной железы после первичной обработки (300 мг на 30 мл,4,7), смешивают с толуольным раствором лецитина (100 мг в 15 мл толуола), затем смесь взбалтывают в течение 60 мин, помещают в делительную воронку и оставляют для разделения на ночь при 4 С. После разделения образовалось три слоя верхний - толуольный (содержал 20 от начальной активности), средний (содержал 50 от начальной активности), нижний - водный (содержал 30 от начальной активности). Слои разделяют и проводят экстракцию фермента из верхнего и среднего слоя слабощелочным раствором. 2.1. Обработка толуольного слоя. Для экстракции фермента к верхнему слою приливают 20 мл 1 раствора бикарбоната аммония ( 7,9), взбалтывают 15 мин на качалке и оставляют для разделения. Получают два слоя верхний - толуольный и нижний - водный (смыв), где предположительно должен находиться фермент. С толуольным слоем повторяют процедуру с промыванием 15 мл 1 раствора бикарбоната аммония ( 7,9). Полученный второй смыв объединяют с предыдущим и отфильтровывают, доводят 1 М соляной кислотой до 4,4 и выдерживают в вакуум-эксикаторе над щелочью и парафином для удаления большей части воды и остатков толуола. Концентрат (2 мл,8,0) фракционируют на колонке с биогелем Р-4,уравновешенной с 1 бикарбонатом аммония. Из трех образовавшихся при разделении пиков ферментативная активность была обнаружена только в первом - А. Активные фракции объединяют и проводят хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе. В результате такой обработки получают препарат фермента (Р-1). Однако характеристики УФ-спектра Р-1 не были удовлетворительными минимум при 253 нм и максимум при 278 нм не были выражены. Электрофорез в полиакриламидном геле показал наличие одной широкой и одной узкой полосы. 2.2. Обработка среднего слоя. Для экстракции фермента к среднему слою приливают 20 мл 1 раствора бикарбоната аммония ( 7,9), взбалтывают 15 мин на качалке и оставляют для разделения. Нижний водный слой отделяют фильтрованием, вдвое упаривают в вакуум-эксикаторе над щелочью и фракционируют на колонке с биогелем Р-4, уравновешенной с 1 бикарбонатом аммония. Из пяти образовавшихся при разделении пиков два обладают ферментативной активностью. Активные фракции в пределах каждого пика объединяют и проводят хроматографию каждого пика раздельно на карбоксиметилцеллюлозе. В результате разделения фракций пика А получают препарат фермента (Р-2), обладающий высокой ферментативной активностью, УФ-спектр которого имеет удовлетворительные характеристики. Физико-химические характеристики полученного препарата представлены в таблице. 8416 1 2006.08.30 Молекулярная масса, кД Содержание основных аминокислот, нмоль 12,20,5(30,0) (4,5) (8,95) (62,2) (3,5) (16,3)(1,0) (2,4) (2,0) Источники информации 1. Литвинко Н.М., Кисель М.А. Эндогенные фософолипазы А 2. Структура и функция. Мн., 1991. 2. Литвинко Н.М., Дрожденюк А.П. Комплексообразование фосфолипазы А 2 с фрагментами нуклеиновых кислот и способы его устранения // Прикладная биохимия и микробиология. - 1996. - Т. 32. -6. - С. 650-655 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4