Способ прогнозирования приступов удушья у детей, больных бронхиальной астмой

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ54 СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ приступов удушья у ДЕТЕЙ,вольных БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙСпособ прогнозирования приступов удушья у детей, больных бронхиальной астмой, включающий добавление к сыворотке крови антигена к аллергоспецифическим 13 Е-антителам к домашней пыли, инкубацию смеси с последующей регистрацией величины оптической плотности, отличающийся тем, что предварительно из сыворотки крови преципитируют(71) Заявитель Белорусский государственный институт усовершенствования врачей(73) Патентообладатель Белорусский государственный институт усовершенствования врачей (НУ)3,75 И, полиэтиленгликолем с М.м. 6000 циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), затем к раствору ЦИК добавляют антиген к аллергоспецифическим дБ-антителам регистрируют оптическую плотность и при ее значении 0,745 единиц и более прогнозируют возникновение приступов удушья.Изобретение относится к медицине, а именно к области клинической иммунологии и аллергологии.Задачей способа является установление конкретного риска развития приступов удушья у ребенка, больного бронхиальной астмой.Выбор определения специфических 15 Е-антител к домашней пыли в составе циркулирующих иммунных комплексов обусловлен тем,что шЕ-антитела являются маркером аллергического процесса.Предлагаемый способ позволяет прогнозировать риск развития приступов удушья у детей,больных бронхиальной астмой, посредством определения содержания ЩЕ-антител к домашней пыли в составе циркулирующих иммунных комплексов. Это важно для своевременного назначения патогенетической терапии и контроля за ее проведением.Предлагаемый способ позволяет прогнозировать риск развития приступов удушья с высокой степенью надежности Р 0,01).время центрифугирования увеличивают до 35 мин. Супернатант сливают и добавляют в пробирки холодный раствор полиэтиленгликоля этой же концентрации, перемешивают и снова центрифугируют. Операцию отмывки повторяют еще раз. Слив супернатант, к осадку добавляют 0,2 мл 0,05 М глицин-НС 1 буфера,рН 2,6 для диссоциации иммунных комплексов. Перемешивают и оставляют в термостате при 37 С на 1 час. В приготовленной таким образом пробе определяют содержание специфических ЩЕ-антител к домашней пыли на тест-системе иммуноферментной для определения аллергенспецифических дБ-антител человека, изготовленной Ставропольским НПО Аллерген, в соответствии с инструкцией, Для осуществления предлагаемого способа из сыворотки крови выделяют Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИЮметодом селективной преципитации с полиэтиленгликолем(М.М. 6000) в конечной концентрации 3,75 5 Полученный првципитат ЦИК осаждают центрифугированием при 5000 об/мин, дважды отмывают ПОЛИЭТИЛСНГЛИКОЛЕМ ЭТОЙ ЖЕ КОН центрации. Затем отмытый осадок подвергают диссоцнашш 0,05 М глицин-НС 1 буфером, рН 2,6, 10 в термостате при 37 С в течение 1 часа. После диссоциации иммунных комплексов специфические дБ-антитела определяют в пробе на тест-системе иммуноферментной для опредеч ления аллергенспецифических дБ-антител че- 15 ловека, изготовленной Ставропольским НПОАллерген. прилагаемой к каждому набору. Способ осуществляется следующим обра- Учет результатов проводят инструментально,зом. на спектрофотометре типа Мультискан придлине волны 492 нм. Оценка содержания специфических ШЕ-антител производится на основе определения оптической плотности (ОП) продукта ферментативной реакции, характеризующей содержание аллергенспецифических 1 вЕ-антител. Для этого рассчитывают среднюю арифметическую ОП дублей всех растворов(А,ВС,Д) стандарта 13 Е-антител и образцов тестируемых сывороток. ОП образцов сравнивают с ОП растворов (А,ВС,Д) стандарта 13 Е 30 антител (см.таблицу 1).К 0,2 мл сыворотки крови добавляют 0,4 мл 20 боратного буфера, рН 8,6 0,1 М, перемешивают и добавляют 5,4 мл раствора полиэтиленгликоля (М.М. 6000) в конечной концентрации 3,75 , приготовленного на боратном буфере. Перемешивают и оставляют при комнатной 25 температуре для образования преципитата на 1 час. Затем переливают в пластмассовые пробирки для центрифуги ОПН-З и центрифугируют при 5000 об/мин 20 минут, однако с учетом времени на разгон и остановку ротораРастворы Р 2 Средние показатели ОП аствоовной астмой. Благодаря количественному анализу ОП образцов, нами установлено, что содержание специфических щЕ-антител к домашней пыли независимо от периода болезни у детей с бронхиальной астмой, было достоверно выше в составе ЦИК, чем в сыворотке крови (см.таблицу 2). При этом следует отметить, что разница в содержании ЩЕ-антител к домашней пыли (д.п.) в составе ЦИК в сравниваемые периоды болезни была более значимой (Р 0,001), чем в эти же периоды болезни в сыворотке крови (Р 0,02).Оценка содержания специфических 15 Е-антител может быть произведена по степени реакции (01,2,34), что соответствует отрицательному, низкому, умеренному, высокому и очень высокому уровню дБ-антитела Однако такой подход не позволяет провести тщательную и точную оценку результатов. Поэтому мы считаем необходимым рассмотреть цифровые данные ОП, полученные на спектрофотометре Мультискан, которые количественно и, соответственно, более реально отражали бы истинное соотношение дБ-антител в сыворотке крови И составе ЦИК у детей с бронхиаль ЮНами были также рассчитаны доверительные интервалы содержания ШЕ-антител к д.п. в сыворотке крови и в составе ЦИК в приступном и межприступном периодах болезни (таблица 3). Как видно из таблицы, количество Е-антител к д.п. от 0,061 ед. до 0,102 ед. ОП находится в пределах доверительного интервала содержания шЕ-антител к д.п. как в межприступном, так и в приступном периоде. Именно по этой причине возникают затруднения при использовании количественных параметров щЕ-антнтел к д.п. в сыворотке крови в дифференциально-диагностических и прогностических целях. Указанный недостаток отсутСТВУСТ ПРИ анализе ДОБЕРИТСЛЬНЫХ ИНТрВЗЛОВ содержания 1 вЕ-антител к д.п. в составе ЦИК в анализируемые периоды. Таким образом, нами установлено, что максимальное количество специфических 1 вЕ-антител к д.п. содержится не в сыворотке крови, а в составе циркулируыющих иммунных комплексов. Кроме того, заслуживает внимания то обстоятельство, чтопределы доверительных интервалов содержания 15 Е-антител в составе циркулирующих иммунных комплексов в разные периоды болезни не перекрываются. Благодаря этому можно достигнуть высокой точности при оценке риска развития приступов удушья и прогноза заболевания. Следовательно, в прогнозировании приступов удушья у ребенка с бронхиальной астмой необходимо опираться на результаты количественного определения аллергенспецифнческих 1 дЕ-антител к д.п. не столько в сыворотке крови, сколько в составе циркулирующих иммунных коашлексов. При этом определение дБ-антител в составе циркулирующих иммунных комплексов более информативно и коррелирует с остротой аллергического процесса и выраженностью сим 20 птоматики заболевания.Примечание 10,01 - доверительный интервал с уровнем достоверности Р 0,01, Пример 1. Ребенок Артур 11., 12 лет, находился в аллергологическом отделении с клиническим диагнозом бронхиальная астма,атопическая, средней тяжести, приступный период. Страдает бронхиальной астмой в течение 8 лет. Состояние ухудшается в мае и октябре. Иммунологическое исследование, проведенное с целью прогнозирования приступов удушья у ребенка по предлагаемому способу уровень 13 Еанттггел к д.п. в сыворотке крови - 0,048 ед. ОП,а уровень дБ-антител к д.п. в составе циркулирующих иммунных комплексов - 0,887 ед. ОП.По содержанию 13 Е-антител к д.п. в сыворотке крови нельзя судить о риске развития приступов удушья, поскольку уровень шЕ-ан тител к д.п. 0,048 ед. ОП находится в пределах доверительного интервала (0,0 З 8 бО,102) содержания 1 рЕ-антител к д.п. в межприступном периоде, но не согласуется с приступным периодом бронхиальной астмы. Уровень ЩЕантител к д.п. в составе циркулирующих иммунных комплексов сыворотки крови 0,887 ед. ОП и лежит в пределах доверительного интервала содержания 13 Е-антител к д.п.(О,74591125) соответствующего приступному периоду болезни, что подтверждается диагнозом приступный период бронхиальной астмы. Это свидетельствует о высоком риске развития приступов удушья у ребенка.Пример 2. Ребенок Костя Б., 8 лет, находился в аллергологическом отделении с клиническим диагнозом бронхиальная астма,тяжелое течение, приступный период. Болеет бронхиальной астмой в течение 7 лет. В течеНИ ПОСЛДНГО МЕСЯЦЕ ПрИСТуПЫ ОЧЕНЬ ЧВСТЫС. Иммунологическое исследование, проведенное с целью прогнозирования приступов удушья у ребенка по предлагаемому способу уровень дБ-антител к д.п. в сыворотке крови равен 0,092 ед. ОП, а уровень ЬдЕ-антител к д.п. в составе циркулирующих иммунных комплексов - 0,975 ед. ОП.По содержанию 13 Е-антител к д.п. в сыворотке крови затруднительно судить о риске развития приступов удушья у ребенка, поскольку уровень 0,092 ед. ОП находится как в пределах доверительного интервала содержания дЕ-антител к д.п. в приступном периоде(00610,1 б 99), так и в пределах доверительного интервала содержания 13 Е-аитител к д.п. в межприступном периоде (0,0380,102). Уровень дБ-антител к д.п. в составе циркулирующих иммунных комплексов сыворотки крови равен 0,975 ед. ОП и лежит в пределах доверительного интервала содержания ЩЕ-антител к д.п. (0,74591,125), соответствующего приступному периоду, что и подтверждается диагнозом приступный период бронхиальной астмы. Это свидетельствует о высоком риске развития повторных приступов удушья у ребенка.Пример 3. Ребенок Света М., 6 лет, находилась в аллергологическом отделении с клиническим диагнозом бронхиальная астма атопическая, средней тяжести, межприступный период. Страдает бронхиальной астмой в течение 4 лет. Последний приступ был 2 месяца назад. Иммунологическое исследование,проведенное с целью прогнозирования приступов удушья у ребенка по предлагаемому способу уровень ШЕ-антител к д.п. в сыворотке крови равен 0,114 ед. ОП, а содержание 13 Еантител к д.п. в составе циркулирующих иммунных комплексов - 0,664 ед. ОП. По содержанию 13 Е-антител к д.п. в сыворотке крови затруднительно судить о риске развития приступов удушья у ребенка, так как уровень 13 Е-антител к д.п. 0,114 ед. ОП находится в пределах доверительного интервала содержания ЦЕ-антител к д.п. в приступном периоде(00610,1699), но не подтверждается диагнозом бронхиальная астма, межприступный период. Напротив, уровень дБ-антител к д.п. в составе циркулирующих иммунных комплексов сыворотки крови равен 0,664 ед. ОП и лежит в пределах доверительного интервала содержания дБ-антител к д.п. (0,42190,672),соответствующего межприступному периоду,что и подтверждается диагнозом межприступный период бронхиальной астмы. Это свидетельствует о том, что риска развития приступов удушья у ребенка пока нет.Таким образом, использование предлагаемого способа прогнозирования приступов удушья у детей, больных бронхиальной астмой, по СРЕВНВНИЮ С ПРОТОТИПОМ ИМЕЕТ СЛЕДУЮЩИЕ преимущества1) предлагаемый способ конкретно прогнозирует риск развития приступов удушья у ребенка, больного бронхиальной астмой,поскольку опирается на точные количественные критерии пределов колебаний содержания ЩЕ-антител к домашней пыли в составе циркулирующих иммунных комплексов в приступном и межприсгупном периодах болезни2) соответствует клинической картине заболевания и является объективным критерием риска развития приступов удушья3) может быть использован с высокой степенью надежности, поскольку доверительные интервалы содержания 13 Е-антител к домашней пыли четко разграничены в приступном и межприступном периоде болезни4) использование способа основано на вьщелении из сыворотки крови циркулирующих иммунных комплексов, их последующей диссоциации на антиген и антитело. Для определения 15 Е-антител используют нммуноферментные тест-системы5) способ несложен в техническом исполнении и может быть применен в любой иммунологической лаборатории при наличии спектрофотометра Мультискан, центрифуги ОПН-З.Таким образом, предлагаемый способ прогнозирования приступов удушья у детей, больных бронхиальной астмой, высокодостоверен и может быть использован в лечебных учреждениях в качестве критерия риска развитияГосударственное патентное ведомство Республики Беларусь.