Способ получения ветеринарного препарата “сублицин” для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕТЕРИНАРНОГО ПРЕПАРАТА СУБЛИЦИН ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ(73) Патентообладатели Романова Людмила Владимировна, Игнатович Людмила Федоровна, Селецкая Татьяна Георгиевна(57) Способ получения ветеринарного препарата для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний, включающий выращивание по отдельности культур штаммов бактерий рода , в том числе штамма, на жидкой питательной среде и смешивание полученных культуральных жидкостей,отличающийся тем, что используют штаммы 124 и 21, осуществляют глубинное выращивание в течение 18-24 ч при постоянной аэрации и перемешивании, смешивают полученные культуральные жидкости штаммов 124 и 21 в соотношении 52, при этом в качестве питательной среды используют среду, содержащую мелассу, аммоний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный и воду при следующем соотношении компонентов, мас. меласса аммоний сернокислый калий фосфорнокислый однозамещенный калий фосфорнокислый двузамещенный вода 4747 1 Изобретение относится к биотехнологии, в частности к промышленной микробиологии, и может найти применение при производстве бактериальных ветеринарных препаратов для профилактики и лечения дисбактериозов и других желудочно-кишечных заболеваний животных, например молодняка сельскохозяйственных животных. Известен способ получения ветеринарного препарата для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний, включающий поверхностное выращивание штамма Вас.44 на плотной питательной среде, снятие биомассы с питательной среды и ее разбавление стерильным физраствором или растворителем вакцин ЛТФ-130 1. Однако данный способ обладает низкой производительностью, а препарат - узкой антибиотической активностью. Известен также способ получения ветеринарного препарата БЦЛ для лечения желудочно-кишечных заболеваний, включающий выращивание по отдельности штаммов Вас. ,,. на жидкой питательной среде, содержащей соевый гидролизат, печеночный бульон, глюкозу и хлорид натрия, в термостате при 36-38 С в течение 72 ч, и смешивании культуральных жидкостей в соотношении 111 2. Однако известный способ является достаточно длительным (72 часа) и дорогостоящим из-за применения печени крупного рогатого скота для приготовления питательной среды и трех штаммов микроорганизмов. Данные недостатки связаны с биологическими свойствами микроорганизмов. Задача изобретения состоит в обеспечении сокращения количества штаммов микроорганизмов и сроков получения препарата и применения дешевой питательной среды. Сущность изобретения заключается в том, что для решения поставленной задачи в заявляемом способе получения ветеринарного препарата для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний, включающем выращивание по отдельности культур штаммов бактерий рода , в том числе штамма, на жидкой питательной среде и смешивание полученных культуральных жидкостей, отличающийся тем, что используют штаммы 124 и 21, осуществляют глубинное выращивание в течение 18-24 ч при постоянной аэрации и перемешивании, смешивают полученные культуральные жидкости штаммов 124 и 21 в соотношении 52, при этом в качестве питательной среды используют среду, содержащую мелассу, аммоний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный и воду при следующем соотношении компонентов, мас.меласса аммоний сернокислый калий фосфорнокислый однозамещенный калий фосфорнокислый двузамещенный вода Штамм Вас.124 является представителем нормальной кишечной микрофлоры здоровых животных (телят). Выделен методом накопительных культур с последующим отбором наиболее активных вариантов. Морфологические признаки. Вас.124 - грамположительные клетки, палочковидные, размером 2,70,85 мкм, подвижные, расположены одиночно или в виде цепочек. Эндоспоры овальные, расположены без строгой локализации. При спорообразовании клетки не раздуваются. Культуральные признаки. На МПА колонии имеют неправильную форму с морщинистой, матовой поверхностью белого цвета с изрезанным фестончатым краем. Колонии легко снимаются петлей с агара. Оптимальная температура роста 37 С. Максимальная продуктивность достигается в интервале 28-37 С. Культура не растет в анаэробных условиях, не гидролизует мочевину. Для хорошего роста необходима интенсивная аэрация. Ферментирует глюкозу, сахарозу, мальтозу с образованием кислоты. Обладает способностью образовывать каталазу и ацетилметилкарбинол (реакция Фогес-Проскауэра положительная). Разжижает желатину, гидролизует крахмал. Не обладает патогенностью, токсичностью в отношении животных. Обладает антагонизмом в отношении патогенных и условно-патогенных кишечных микроорганизмов. Устойчив к линкомицину, цефазолину, цефатоксину, полимиксину и сульфаниламидным препаратам. Чувствителен к гентамицину, тетрациклину, эритромицину, канамицину. Условия и состав сред для хранения штамма. 2 4747 1 В лиофильно высушенном виде или на МПА (1,5 , 0,75 ) при температуре 52 С. Способ определения активности штамма. Чашечный метод. Метод основан на приготовлении ряда последовательных разведений культуральной жидкости в стерильной водопроводной воде с высевом на агаризованные среды в чашки Петри, с подсчетом выросших колоний. Типичность выросших колоний штамма определяют по культурально-морфологическим признакам. Штамм Вас.21 выделен из кишечника телят методом накопительных культур с последующим отбором наиболее активных вариантов. Морфологические признаки. Вас.21 - грамположительные спорообразующие палочки, размером 2,00,6 мкм. Клетки подвижные, перитрихи, располагаются одиночно или в виде цепочек. Эндоспоры овальной формы располагаются в клетке центрально. Клетки при спорообразовании не раздуваются. Капсул не образует. Культуральные признаки. На МПБ и на жидкой мелассной среде культура образует осадок. На МПА - колонии серовато-белого цвета, непрозрачные, край ровный. Форма колоний круглая, выпуклая, поверхность гладкая. На агаризованной среде с мелассой колонии матовые серого цвета, центр чуть приподнят и уплотнен. Форма колоний круглая, край слегка волнистый. Колонии легко снимаются петлей с агаризованных сред. Оптимальная температура роста 37 С. Максимальная продуктивность достигается в интервале 28-37 С. Физиолого-биохимические признаки. Культура образует каталазу и ацетилметилкарбинол (реакция Фогес-Проскауэра положительна). Разжижает желатину, гидролизует крахмал. Ферментирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннит с образованием кислоты. Редуцирует нитраты и способна расти за счет анаэробного нитратного дыхания. Не обладает патогенностью и токсичностью в отношении животных. Штамм устойчив к полипептидам и -лактамным антибиотикам, сульфаниламидным препаратам. Обладает антибиотической активностью в отношении,, сальмонелл,протея. Условия и состав сред для хранения штамма. В лиофильно высушенном виде или на МПА (1,5 , 0,75 ) при температуре 52 С. Способ определения активности. Активность штамма определяют тем же методом, что и у Вас.124. Типичность выросших колоний штамма определяют по культурально-морфологическим признакам. Способ осуществляют следующим образом. Музейную культуру штаммов бактерий Вас.124 и Вас.21 высевают на скошенный мясо-пептонный агар в пробирках. Пробирки помещают в термостат и выдерживают при 37 С в течение 1618 ч. Полученный посевной материал обоих штаммов помещают в разные емкости с питательной средой, где и осуществляют глубинное выращивание штаммов, при этом культуральную жидкость постоянно аэрируют и перемешивают, а питательную среду используют следующего состава, мас.меласса 3,8-4,2 0,9-1,1 аммоний сернокислый (4)24 0,45-0,55 калий фосфорнокислый однозамещенный (КН 2 РО 4) 0,045-0,055 калий фосфорнокислый двузамещенный (К 2 НРО 4) вода остальное. Выращивание осуществляют при 26-37 С,6,8-7,2 и аэрации 0,5 м 3 воздуха на 1 м 3 в течение 18-24 ч. После выращивания для получения конечного продукта суспензии обоих штаммов смешивают в соотношении 52. Данное соотношение обеспечивает титр живых микробных клеток не менее 3109 в 1 мл и является оптимальным для проявления антибиотической активности конечного продукта. Изобретение поясняется конкретными примерами. Пример 1. Музейные культуры штаммов Вас.124 и Вас.21 помещали в разные емкости с питательной средой, мас.меласса 3,8 0,9 аммоний сернокислый (4)24 0,45 калий фосфорнокислый однозамещенный (КН 2 РО 4) 0,045 калий фосфорнокислый двузамещенный (К 2 НРО 4) вода остальное. 3 4747 1 Выращивание осуществляли при 28 С,среды 6,8 аэрации 0,5 м 3 воздуха на 1 м 3 в течение 24 ч. После окончания выращивания для получения конечного продукта суспензии обоих штаммов Вас.124 и Вас.21 смешивали в соотношении 52, соответственно. Титр жизнеспособных клеток в 1 мл препарата составил 3,5109. Пример 2. Способ осуществляли, как в примере 1 за исключением питательную среду использовали следующего состава, мас.меласса 4,0 1,1 аммоний сернокислый (4)24 0,55 калий фосфорнокислый однозамещенный (КН 2 РО 4) 0,055 калий фосфорнокислый двузамещенный (К 2 НРО 4) вода остальное. Выращивание осуществляли при 37 С,среды 7,2 аэрации 0,5 м 3 воздуха на 1 м 3 в течение 18 ч. Титр жизнеспособных клеток в 1 мл препарата составил 4,4109. Таким образом, изобретение позволяет сократить количество штаммов микроорганизмов с 3 до 2, сократить время получения препарата со 120 ч до 42 ч и удешевить получение препарата за счет применения дешевой питательной среды. Источники информации 1. А.с. СССР 1563699, МПК А 61 К 35/74, 1990. 2. Заявка 94026123 на выдачу патента РФ на изобретение, МПК А 61 К 35/66, 1996. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.