Водорастворимый цианиновый краситель в качестве фотоактивного антимикробного препарата

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ВОДОРАСТВОРИМЫЙ ЦИАНИНОВЫЙ КРАСИТЕЛЬ В КАЧЕСТВЕ ФОТОАКТИВНОГО АНТИМИКРОБНОГО ПРЕПАРАТА(71) Заявитель Белорусский государственный университет(72) Авторы Самцов Михаил Петрович Луговский Анатолий Петрович Воропай Евгений Семенович Луговский Александр Анатольевич Ляшенко Людмила Сергеевна Ермакова Татьяна Сергеевна Титов Леонид Петрович(73) Патентообладатель Белорусский государственный университет в качестве фотоактивного антимикробного препарата. Изобретение относится к новому органическому соединению, в частности индотрикарбоцианиновому красителю формулы , ковалентно связанному с тетраэтиленгликолем,3 которое использовано в качестве фотоактивного антимикробного препарата. Данное соединение в микробной смеси при облучении лазерным излучением с длиной волны в области 18028 1 2014.02.28 ближнего ИК-диапазона обладает выраженной антимикробной активностью в отношении грамположительных бактерий (. ) и грибов рода кандида. Кроме того, краситель обладает достаточно высокой растворимостью в водной и водно-спиртовой среде. Наиболее близким по структуре и проявляющим аналогичную биологическую активность является соединение формулы 3 3 Данное соединение имеет плохую растворимость в водном растворе. При приготовлении при достижении рабочей концентрации раствор красителя неустойчив и выпадает в виде суспензии. Это ограничивает область применения данного соединения 1. Одним из лучших из известных соединений, используемых для фотодинамической антимикробной терапии, является соединение се 6-5 К, представляющее собой хлорин е 6,связанный с пентализином 2. Данное соединение относится к классу порфиринов с областью поглощения 630-680 нм и обладает противомикробной фотоактивностью относительно как грамположительных бактерий ( ,),так и грамотрицательных ( ,. ,,,). Однако сравнительно с предлагаемым нами полиметиновым красителем, имеющий максимум поглощения 720-740 нм, порфирин се 6-5 К имеет меньший на порядок коэффициент экстинции, а лазерное излучение с длиной волны 660 нм, которое обычно используется для се 6-5 К, имеет более слабое проникновение в биологическую ткань, чем излучение 740 нм. Кроме того, заявляемое нами соединение на порядок дешевле прототипа, для которого необходим дорогостоящий пентализин и сложная система очистки конечного продукта 2. Задачей изобретения является новое органическое соединение формулы , которое получается по доступной синтетической схеме и отличается простотой выделения и низкой ценой, проявляет выраженную антимикробную фотоактивность, обладает хорошей растворимостью в воде, имеет максимум полосы поглощения в более длинноволновой области в биологических структурах. Данная задача решалась путем одностадийного привития на индотрикарбоцианиновый краситель со свободной карбоксильной группой тетраэтиленгликоля. Привитие гидрофильной группы резко повышает растворимость соединения , а ковалентное связывание с тетраэтиленгликолем, в отличие от межмолекулярного связывания, устойчиво к сольватационному разрушению. Соединениеполучают конденсацией производных глутаконового альдегидас четвертичной солью индоленина , содержащей активную метиленовую группу. Производные глутаконового альдегида были получены аминоформилированием 2-инданона 3, с последующим выделением в водном растворе . Четвертичную сольполучали реакцией конденсации 2,3,3-триметилиндоленина с полученным сложным эфиром броммасляной кислоты и тетраэтиленгликоля в нитрометане. 3 Важной характеристикой противомикробных средств является их активность не только в отношении стандартных тест-культур, но и в отношении клинических штаммов, циркулирующих в стационарах в настоящее время, т.к. последние могут отличаться по чувствительности к химиотерапевтическим агентам от стандартных штаммов. В этой связи было проведено изучение противомикробной активности соединенийкак в отношении тестмикробов, так и в отношении клинических изолятов. Экспериментальные данные биологических испытаний соединений (- ) представлены в табл. 1. Пример 1. Синтез эфира бромида 1-(3-карбокеипропил)-3-алкил-2,3)5-триметил-3-индолия и поэтиленгликоля . 0,1 моль соответствующего индоленина и 0,1 моль эфира гаммаброммасляной кислоты и полиэтиленгликоля в 150 мл нитрометана кипятили в течение 3 ч. Из полученной смеси отгоняли растворитель и добавляли 100 мл диэтилового эфира. Выпавшее масло отделяли декантацией и промывали еще два раза диэтиловым эфиром. ЯМР 1,м.д.0,55 м (2, 1-22), 0,77 с (6 в 2-), 1,29 с (3, 2-), 3,2 т (2, 1-32),3,9 м.д. т (2, 1-С 12), 7,6-8,1 м (-), 3,6-3,7 м (2-ПЭГ) (ДМСО-6, ). Выход 67 . Пример 2. Синтез диэфира бромида 2-7-1-(3-карбоксипропил)-3,3-Диметил-2(1)-индолинилиден-4-хлор-3,5-(о-фенилен)-1,3,5-гептатриенил-1-ил-1-(3-карбокси-пропил)-3,3-диметилиндолия и тетраэтиленгликоля. . Смесь 0,001 м эфира бромида 1-(3-карбоксипропил)-3 алкил-2,3,5-триметил-3-индолия и поэтиленгликоля (-) и 0,0005 м соли 5-диметиламино-3-7-2,4-(о-фенилено)-2,4-пентадиен-1-илиден-диметиламмонияв 15 мл уксусного ангидрида и 0,5 мл -метилморфолина кипятили 5 мин. После охлаждения в реакционную смесь добавляли 150 мл диэтилового эфира и через 1 ч выпавший продукт отфильтровали,и переосаждали из хлористого метилена диэтиловым эфиром. ЯМР , м.д. (б) 0,42 т(2, 1-12), 7,2-7,8 м (-), 8,17-8,45 м , 3,6-3,7 м (2-ПЭГ) (ДМСО-еб, ). Выход 46 . Пример 3. Противомикробную активность синтезированного соединения изучали в опытах. Растворение химиопрепаратов, получение микробной смеси, выращивание микроорганизмов проводили по стандартной методике. Минимальную подавляющую рост микроорганизмов концентрацию, определяли методом 2-кратных серийных разведений в жидкой питательной среде - мясо-пептонном бульоне согласно методике, описанной ранее 4. Бактерицидную концентрацию определяли при последующем пересеве с мясо-пептонного бульона на чашки с мясо-пептонным агаром. О минимальных бактерицидных концентрациях исследуемых препаратов судили по отсутствию роста микроорганизмов на мясопептонном агаре. Результаты определения темновой токсичности препарата приведены в таблице. Пример 4. Штаммы микроорганизмов . аигет и(граммположительные) подвергались 60 минутной инкубации в присутствии исследованных препаратов в темноте при 37 С. После инкубации исследуемые растворы разливали по пенициллиновым флаконам 3 18028 1 2014.02.28 для облучения и добавляли определенную концентрацию соединения . Флаконы помещались под излучение полупроводникового светодиодного лазера с длиной волны 740,7 нм и плотностью мощности 40 мВт/см 2. Энергетическая экспозиционная доза излучения полупроводникового лазера составляла 25 Дж/см. После эксперимента исследуемую суспензию высеивали в чашки Петри, которые помещали в термостат на сутки (или в зависимости от вида штамма) при температуре 37 С. Затем производили подсчет выросших колоний, бактериальная жизнеспособность определялась как способность клеток к формированию колоний на питательном агаре. Выживаемость организмов под действием препарата и лазерного излучения приведены в таблице. Без использования фотооблучения соединениепроявляет умеренную антимикробную и антистафиллококковую активность. Использование препарата совместно с облучением лазерным излучением с длиной волны 740 нм значительно усиливает его терапевтический эффект. Антимикробная активность химиопрепарата и активность под действием лазерного излучения (740 нм,40 мВт/см 2,11 мин,25 Дж/см 2). Антимикробная активность химиопрепарата в мкг/мл Выживаемость организмов под действием химиопрепарата и лазерного излучения Таким образом, заявляемое соединение синтезируется по схеме, отличающейся простотой выделения и дешевизной, и характеризуется высокой растворимостью в водной и водноспиртовой среде, выраженной антистафилококковой и противогрибковой активностью под действием лазерного излучения в ближнем инфракрасном диапазоне и может найти применение в фотодинамической антимикробной терапии. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4