Способ иммунологической диагностики инфекционного мононуклеоза

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО МОНОНУКЛЕОЗА(71) Заявитель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Авторы Генералов Игорь Иванович Дмитраченко Татьяна Ивановна Железняк Наталья Васильевна(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(56) КИШКУН А.А. Иммунологические и серологические исследования в клинической практике. - М. Медицинское информационное агентство, 2006. С. 339-346.а 20060184, 2007.2360254 С 1, 2009.2299439 С 1, 2007.8019 , 2005. МОИСЕЕВА А.М. Вестник Витебского государственного медицинского университета, 2009. - Т. 8. -2. - С. 48-57. ГЕНЕРАЛОВ И.И. и др. Иммунология. - 2009. - Т. 30. -2. - С. 123-128.(57) Способ иммунологической диагностики инфекционного мононуклеоза, отличающийся тем, что из сыворотки крови больного выделяют аффинной хроматографией на протеинеилиполиклональные иммуноглобулиныи диагностируют инфекционный мононуклеоз при выявлении у поликлональных иммуноглобулиновоптическим методом с использованием -лизин-р-нитроанилида в качестве субстрата лизин-амидазной активности. Изобретение относится к медицине и может быть использовано в медицинской практике для диагностики инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом герпеса 4 типа или вирусом Эпштейна-Барр . Способ основан на определении собственной каталитической (абзимной) активности поликлональных иммуноглобулинов класса, появляющихся при данной болезни. В настоящее время в диагностике инфекционного мононуклеоза используется несколько методов 1. Помимо клинического обследования больного, в качестве метода скрининга на первом этапе применяется определение гетерофильных антител , продукция которых значительно увеличивается при данном заболевании. В качестве подтверждающих лабораторных методов используются различные варианты иммуноферментного анализа для определенияк нескольким антигенам (АГ) . Однако данные способы обеспечивают лабораторное подтверждение диагноза инфекционного мононуклеоза не во всех случаях. В наставлениях по иммуноферментному анализу для диагностики данного заболевания указывается, что результаты анализа необходимо оценивать в комплексе с клиническими данными и результатами других лабораторных исследований 2. 16851 1 2013.02.28 До настоящего времени каталитическая активность антител и иммуноглобулинов не использовалась в качестве специального диагностического критерия для установления диагноза инфекционного мононуклеоза. Прототипом заявляемого способа является реакция агглютинации Пауля-Буннеля по выявлению гетерофильныхв сыворотке крови больных инфекционным мононуклеозом 1. Метод включает несколько стадий получение сыворотки от больного определение гетерофильныхв реакции агглютинации, при установлении титравыше 1224 устанавливают диагноз заболевания. Недостатком метода является то, что реакция положительна не только при инфекции вирусом Эпштейна-Барр, у детей чувствительность метода составляет менее 70 при специфичности 20 . Задачей изобретения является разработка нового метода лабораторной диагностики инфекционного мононуклеоза посредством определения лизин-амидазной активности поликлональных , выделенных из сыворотки крови больных данным заболеванием. Метод обеспечивает более высокую эффективность диагностики инфекционного мононуклеоза. Сущность изобретения заключается в том, что после получения препарата поликлональных иммуноглобулинов из сыворотки крови аффинной хроматографией на протеинеилипроводят определение их каталитической лизин-амидазной активности в случае положительной реакции устанавливают диагноз инфекционного мононуклеоза. Способ осуществляют следующим образом материалом для исходного получения препаратов поликлональных каталитических иммуноглобулинов служат сыворотки больных инфекционным мононуклеозом. Для получения гомогенного препарата поликлональных , пригодного для оценки абзимной активности, проводят его выделение из сывороток больных. 1. Кровь в количестве 1-3 мл без добавления антикоагулянта инкубируют в течение 2 часов при температуре 4 С до образования сгустка. Затем центрифугируют 10-15 минут в центрифужных пробирках в центрифуге с бакетным ротором (1500 об/мин). Аккуратно забирают чистую сыворотку. 2. К сыворотке прибавляют охлажденный до 4 С 0,75 раствор риванола в соотношении 1 объем риванола к 2 объемам сыворотки. Смесь инкубируют при температуре 4 С не менее 2 часов. 3. Осадок отбрасывают. Риванол из надосадочной жидкости удаляют гель-фильтрацией на мелкопористой декстрановой матрице Молселект Г 10 или Сефадекс 25(элюент - 0,15 М раствор хлорида натрия на 0,01 М ФБР,7,2-7,4). Для этого декстрановую матрицу размещают в полипропиленовой колонке объемом 12-14 мл диаметром 10 мм, объем сорбента составляет 8-10 мл. Элюцию проводят со скоростью 10-15 капель в минуту. Окончание разделения контролируют визуально по окрашенному переднему фронту прохождения риванола через выход колонки. Далее проводят аффинную хроматографию, пропуская препарат через колонку с агарозой, конъюгированной с протеином А золотистого стафилококка, уравновешенную 0,1 М фосфатным буфером со скоростью 6-7 капель в минуту. Колонку последовательно промывают 0,1 М фосфатным буфером,7,4, с 1 раствором тритона Х-305, а затем без детергента в количестве 5-6 объемов колонки до исчезновения белка в элюенте. 4. Элюцию связавшихся иммуноглобулинов класса(1, 2, 4) проводят 0,02-0,05 М глицин- буфером,2,8, на 0,15 М растворедо исчезновения белка в элюенте(отбирают отдельно фракции по 1,5-2 мл). Фракции, содержащие наиболее высокие концентрации белка, объединяют. Их нейтрализуют 1 М раствором Трис или 1 М глицин- буфером,9,0 до 7,0-7,5. Концентрацию белка в полученных образцах определяют спектрофотометрически на длине волны 280 нм. 2 16851 1 2013.02.28 Для подтверждения диагноза инфекционного мононуклеоза с возможностью его дифференциальной диагностики от других герпетических инфекций проводят определение лизин-амидазной абзимной активности выделенных препаратов . Готовят раствор субстрата -лизиннитроанилида (ЛНА) в концентрации 0,5 мг/мл,при этом растворяют его точную навеску в минимальном объеме диметилсульфоксида и разбавляют реакционным трис- буфером,8,3, в соотношении 1/20. К 0,2 мл раствора субстрата на трис- буфере 8,3 прибавляют 0,05 мл препарата(концентрация - 0,5 мг/мл). Конечная реакционная смесь содержит 0,02 азид . В качестве контроля используют реакционный буфер. Инкубируют в течение 20 часов при температуре 37 С. Реакцию ставят в планшетах для ИФА. Опытные и контрольные пробы дублируют. Учет проводят на многоканальном фотометре (двухволновое измерение на 405 и 570 нм). Результаты выражают в единицах оптической плотности (ЕОП). Определяют положительные образцы. Для этого к среднему значению оптической плотности контроля прибавляют его утроенное стандартное отклонение средние значения опытных проб, превышающие данную величину, считают положительными. Установлено, что положительная лизин-амидазная активность является высокоспецифичной для инфекционного мононуклеоза. При других вирусных заболеваниях частота обнаружения этого вида активности была минимальной. При инфекционном мононуклеозе она обнаруживалась у 11 больных из 19, тогда как при другой герпетической инфекции она была обнаружена в единичных случаях (1 из 8 больных инфекцией(вирус герпеса 1 типа) 1 из 11 больных ветряной оспой (вирус герпеса 3 типа) не обнаружена при инфекции). Данный вид активности не был обнаружен при вирусных гепатитахи(30 обследованных пациентов), а также у здоровых лиц (24 здоровых донора). Проведен расчет операционных характеристик данного теста для диагностики инфекционного мононуклеоза. В качестве групп сравнения использована контрольная группа доноров (24 человека), а также объединенная группа больных другой герпетической инфекцией (25 человек). Рассчитана диагностическая чувствительность, специфичность, диагностическая эффективность теста, прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов, отношение правдоподобия положительного и отрицательного результата 3. При сравнении с контрольной группой доноров эти показатели являются следующими диагностическая чувствительность установления диагноза инфекционного мононуклеоза по ЛНА-тесту - 58 специфичность - 100 диагностическая эффективность теста - 81,4 прогностическая ценность положительного результата - 100 прогностическая ценность отрицательного результата - 75 отношение правдоподобия положительного результата - деление на 0 отношение правдоподобия отрицательного результата - 0,42. Эти показатели соответствуют критериям полезного теста для установления диагноза инфекционного мононуклеоза при дифференциации его от здоровых лиц. При дифференциации инфекционного мононуклеоза от другой герпетической патологии получены следующие значения данных параметров диагностическая чувствительность установления диагноза инфекционного мононуклеоза по ЛНА-тесту - 58 специфичность - 92 диагностическая эффективность теста - 77 прогностическая ценность положительного результата - 84,6 прогностическая ценность отрицательного результата - 743 16851 1 2013.02.28 отношение правдоподобия положительного результата - 7,25 отношение правдоподобия отрицательного результата - 0,45. Эти параметры также соответствуют критериям полезного теста для установления диагноза инфекционного мононуклеоза при дифференциации его от другой герпетической инфекции 3. Определение лизин-амидазной активности предлагается использовать в качестве дополнительного лабораторного критерия с высокой специфичностью при установлении диагноза инфекционного мононуклеоза. Источники информации 1. Кишкун А.А. Иммунологические и серологические исследования в клинической практике. - М. Медицинское информационное агентство, 2006. - С. 339-346. 2. Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов классак ранним белкам вируса Эпштейна-Барр Инструкция по применению. - Новосибирск ЗАО Вектор-Бест, 2009. - С. 18. 3.. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4