Адъювант для инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, инфекционной бурсальной болезни и инфекционного ларинготрахеита птиц

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ АДЪЮВАНТ ДЛЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ, ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР,ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ И ИНФЕКЦИОННОГО ЛАРИНГОТРАХЕИТА ПТИЦ(71) Заявитель Учреждение образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины(72) Авторы Прудников Виктор Сергеевич Бирман Борис Яковлевич Громов Игорь Николаевич(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины(56) ЛЯХ А.Л. Влияние иммуностимулятора натрия тиосульфата на иммуноморфогенез при парентеральной вакцинации гусят против пастереллеза Автореф. дис. - Витебск, 2003. - С. 15. ПРИБЫТЬКО С.П. Влияние иммуностимулятора натрия тиосульфата на иммуноморфогенез у цыплят, вакцинированных против болезни Марека Автореф. дис. - Витебск, 1998. - С. 13.4966 С 1, 2003.2199341 С 2, 2003. ГРОМОВ И.Н. и др. Молодежь, наука,аграрное образование и производство Сб. трудов молодых ученых и преподавателей сельскохозяйственных учебных и научно-исследовательских заведений. Витебск, 1999. - С. 69-72. ПРУДНИКОВ В.С. и др. Птицеводство Беларуси. - 2003. -2. - С. 19-20. ЛЯХ Ю.Г. и др. Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных. Материалы международной научнопрактической конференции. - Минск,2000. - С. 298-300.(57) Адъювант инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, инфекционной бурсальной болезни и инфекционного ларинготрахеита птиц, содержащий минеральное масло 52 и натрия тиосульфат, причем минеральное масло в вакцине составляет 13 массовых частей по отношению к 7 массовым частям гомогената инактивированных 0,5 -ным формалином антигенов возбудителей указанных заболеваний, содержащего 20 мас.натрия тиосульфата. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к вакцинологии. Оно может быть использовано в производстве инактивированных противовирусных вакцин. В комплексе мероприятий по профилактике и ликвидации вирусных болезней птиц главное место занимает специфическая профилактика с использованием живых и инактивированных вакцин. При этом защита цыплят раннего возраста достигается путем созда 14134 1 2011.02.28 ния высокого уровня трансовариального иммунитета. С этой целью молодняк кур иммунизируют инактивированными вакцинами. Живые вакцины применяют по мере снижения уровня трансовариальных антител. Технология производства инактивированных вакцин против вирусных болезней включает изготовление матриксных и производственных расплодок вирусов на культуре клеток или развивающихся куриных эмбрионах, инактивацию расплодок высокой температурой, димером этиленамина или формалином, приготовление адъювантов и последующее составление вакцины 5. В качестве адъювантов используются минеральные масла, нафтеновые углеводороды, липосомы, фуллерен, гидроокись алюминия, сапонин 6, 7, 8, 10. Наиболее близким техническим решением к предлагаемому способу является технология приготовления инактивированной эмульгированной ассоциированной вакцины против ньюкаслской болезни (НБ), инфекционного бронхита кур (ИБК), инфекционной бурсальной болезни (ИББ) и инфекционного ларинготрахеита птиц (ИЛТ) 1. Для производства вакцины используются вирусы ньюкаслской болезни (штамм КМИЭВ-36), инфекционного бронхита кур (штамм КМИЭВ-37), инфекционной бурсальной болезни (штамм КМИЭВ-13), инфекционного ларинготрахеита птиц (штамм КМИЭВ-20). Производственные расплодки вирусов получают на развивающихся куриных эмбрионах. С этой целью проводится заражение 9-дневных эмбрионов соответствующими штаммами вирусов. Инкубируют эмбрионы в течение 72 ч при температуре (37,00,5) С. Сырьем для приготовления вакцины служат экстраэмбриональная жидкость, хорион-аллантоисные оболочки и тела инфицированных эмбрионов. Для инактивации вируссодержащего материала используется 0,5 -ный раствор формалина. Конструирование вакцины производят путем смешивания инактивированных антигенов (гомогенизированных в 0,5 -ном растворе формалина) с минеральным маслом 52 (адъювантом) в массовом соотношении 713. Однако этот способ не лишен недостатков в силу ряда причин недостаточные иммуногенные свойства биопрепарата, его остаточная реактогенность, снижение иммунного статуса птиц 1. Это обусловливает необходимость конструирования вакцины с использованием новых адъювантных препаратов, обладающих иммуностимулирующим действием 9, 11. В ряде работ показано положительное влияние натрия тиосульфата на процессы иммуногенеза у млекопитающих и птиц при вакцинации против вирусных и бактериальных инфекций 2, 3, 4. Установлено, что при совместном применении вакцин совместно с натрия тиосульфатом в органах иммунной системы развиваются более выраженные иммуноморфологические изменения и формируется более напряженный иммунитет, чем при иммунизации без натрия тиосульфата. Вместе с тем ранее при конструировании инактивированных вакцинных препаратов натрия тиосульфат в качестве адъюванта не применялся. Цель изобретения - применение нового адъюванта с целью повышения иммуногенных и снижения остаточных реактогенных свойств инактивированной эмульгированной вакцины против НБ, ИБК, ИББ и ИЛТ, усиления иммунного статуса и напряженности поствакцинального иммунитета у птиц. Поставленная цель достигается тем, что при конструировании инактивированной вакцины применяется новый адъювант, содержащий минеральное масло 52 и иммуностимулятор натрия тиосульфат. Способ осуществляется следующим образом. Сначала готовят раствор, содержащий 20 мас.натрия тиосульфата и 0,5 мас.формалина. Полученную смесь используют для инактивации и гомогенизации антигенов. Конструирование вакцины производят путем смешивания инактивированных антигенов (гомогенизированных в 0,5 -ном растворе формалина, содержащем 20 мас.натрия тиосульфата), с минеральным маслом 52 в массовом соотношении 713. Таким образом, конечная концентрация натрия тиосульфата в вакцине составляет 7 . Установлено, что иммунизация птиц вакциной против НБ, ИБК, ИББ и ИЛТ, приготовленной с использованием нового адъюванта, содержащего минеральное масло 2 14134 1 2011.02.2852 и натрия тиосульфат, предупреждает развитие в ткани на месте введения патоморфологических изменений в виде гнойного и альтеративного воспаления. В то же время в ткани на месте введения вакцины, содержащей новый адъювант, активизируются микрои макрофагальная реакция, бласттрансформация лимфоцитов и плазматизация (табл. 1),происходит формирование крупных лимфоидных узелков. В ткани на месте введения жидкой инактивированной эмульсинвакцины против НБ,ИБК, ИББ и ИЛТ, приготовленной с использованием в качестве адъюванта минерального масла 52 (без натрия тиосульфата), отмечаются явления выраженного серозно-воспалительного отека, воспалительной клеточной инфильтрации, гнойного воспаления, деструкции мышечных волокон. В дальнейшем на месте поврежденных структур происходит развитие грануляционной ткани с последующей организацией. Введение указанной вакцины обусловливает развитие умеренной плазмоцитарной реакции. Таблица 1 Плазмоцитарная реакция в ткани с места введения вакцины (, ) Группы ЛимфоПлазмоМитозы Всего птиц бласты бласты Проплазмоциты Плазмоциты на 3-й день после вакцинации 0,500,28 5,000,84 8,251,12 7,501,40 7,251,69 28,503,37 1 группа 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-30,05 1-30,05 1-30,01 1-30,05 1-30,05 1-30,01 0,250,28 4,750,84 7,251,40 6,751,40 6,751,40 25,752,81 2 группа 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,01 3 группа 0,250,28 2,000,56 2,750,84 3,000,56 5,000,56 13,001,69 на 7-й день после вакцинации 0,250,28 4,751,40 6,251,40 6,001,12 10,251,97 27,500,560,050,050,050,050,050,05 1 группа 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 1-30,001 0,750,28 3,750,84 5,251,40 5,501,12 9,501,12 24,753,37 2 группа 0,050,050,050,050,050,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 0,750,56 2,500,84 3,250,84 3,250,84 4,750,84 14,501,97 3 группа 0,050,050,050,050,050,05 на 14-й день после вакцинации 0,750,28 4,001,69 3,501,40 3,500,84 7,501,97 19,251,970,050,050,050,050,050,01 1 группа 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 0,500,28 3,250,84 3,001,12 2,500,56 6,751,40 16,000,56 2 группа 0,050,050,050,050,050,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 0,500,28 3,000,84 2,500,84 2,000,84 4,501,12 12,500,84 3 группа 0,050,050,050,050,050,05 Примечание 1 группа - иммунизированы вакциной, приготовленной с использованием нового адъюванта (минеральное масло 52 натрия тиосульфат) 2 группа - иммунизированы вакциной, приготовленной с использованием минерального масла 52 (без натрия тиосульфата) 3 группа - контроль (интактная птица) 1-2 - 1-2 группы 1-3 - 1-3 группы 2-3 - 2-3 группы- по сравнению с предыдущим сроком исследований. 3 14134 1 2011.02.28 Применение вакцины, приготовленной с использованием нового адъюванта (минеральное масло 52 натрия тиосульфат), вызывает у птиц более выраженную иммуноморфологическую перестройку костного мозга по сравнению с применением прототипа (вакцины, содержащей в качестве адъюванта минеральное масло 52),что проявляется тромбоцитозом, лимфоцитозом, статистически достоверным увеличением лейко-эритробластического индекса на 20(табл. 2). Таблица 2 Парциальные формулы различных групп костномозговых клеток у птиц (, ) Группы Лейкоэритроблас- Индекс созревания Индекс созревания Индекс созревания птиц тический индекс псевдоэозинофилов эозинофилов эритронормобластов на 3-й день после вакцинации 1,010,07 0,720,09 0,610,15 0,440,01 1 группа 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-30,01 1-30,05 1-30,05 1-30,05 0,840,05 0,690,15 0,630,07 0,470,07 2 группа 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 3 группа 0,710,03 0,620,10 0,570,10 0,440,05 на 7-й день после вакцинации 0,930,09 0,670,07 0,510,05 0,510,040,050,050,050,05 1 группа 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 0,870,04 0,610,12 0,490,08 0,510,06 2 группа 0,050,050,050,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 0,790,03 0,520,06 0,470,07 0,520,07 3 группа 0,050,050,050,05 на 14-й день после вакцинации 0,900,08 0,500,04 0,620,06 0,390,050,050,050,050,05 1 группа 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 0,830,06 0,600,03 0,520,06 0,420,01 2 группа 0,050,050,050,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 0,750,06 0,590,11 0,510,09 0,440,04 3 группа 0,050,050,050,05 Примечание 1 группа - иммунизированы вакциной, приготовленной с использованием нового адъюванта (минеральное масло 52 натрия тиосульфат) 2 группа - иммунизированы вакциной, приготовленной с использованием минерального масла 52 (без натрия тиосульфата) 3 группа - контроль (интактная птица) 1-2 - 1-2 группы 1-3 - 1-3 группы 2-3 - 2-3 группы- по сравнению с предыдущим сроком исследований. Использование инактивированной вакциной против НБ, ИБК, ИББ и ИЛТ, содержащей новый адъювант, обеспечивает по сравнению с применением вакцины, содержащей минеральное масло 52, повышение органометрических показателей тимуса,фабрициевой бурсы и селезенки, возрастание удельных объемов лимфоидной ткани и расширение коркового вещества долек в тимусе (табл. 3). 4 14134 1 2011.02.28 Таблица 3 Микроморфометрические показатели долек тимуса птиц (, ) Размеры, мкм Удельные объемы,Группы птиц корковое вещество мозговое вещество паренхима строма на 3-й день после вакцинации 497,0058,43 388,0041,85 91,501,40 8,501,40 1 группа 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-30,01 1-30,05 1-30,05 1-30,05 409,5048,60 410,0055,34 90,000,56 10,000,56 2 группа 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 3 группа 255,7527,25 371,5026,40 88,000,56 12,000,56 на 7-й день после вакцинации 383,7542,42 394,2578,09 91,000,56 9,000,560,050,050,050,05 1 группа 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 349,2524,44 378,0058,43 89,001,12 11,001,12 2 группа 0,050,050,050,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 256,2530,62 408,2556,46 88,751,12 11,251,12 3 группа 0,050,050,050,05 на 14-й день после вакцинации 313,5035,39 310,5047,75 87,001,69 13,001,690,050,050,050,05 1 группа 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 324,5029,78 280,0043,82 87,251,97 12,751,97 2 группа 0,050,050,050,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 327,0035,39 273,0037,92 86,251,40 13,751,40 3 группа 0,050,050,050,05 Примечание 1 группа - иммунизированы вакциной, приготовленной с использованием нового адъюванта (минеральное масло 52 натрия тиосульфат) 2 группа - иммунизированы вакциной, приготовленной с использованием минерального масла 52 (без натрия тиосульфата) 3 группа - контроль (интактная птица) 1-2 - 1-2 группы 1-3 - 1-3 группы 2-3 - 2-3 группы- по сравнению с предыдущим сроком исследований. Применение инактивированной вакцины, приготовленной с использованием нового адъюванта (минеральное масло 52 натрия тиосульфат) предупреждает развитие у птиц зернистой и мелкокапельной жировой дистрофии гепатоцитов, вакуольной дистрофии панкреацитов, зернистой дистрофии эпителия почек, нормализует активность гепатозависимых ферментов (аспартатаминотрансферазы (АсТ), аланинаминотрансферазы(АлТ), гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), щелочной фосфатазы (ЩФ и уровень мочевой кислоты в плазме крови (табл. 4). 14134 1 2011.02.28 Таблица 4 Биохимические показатели плазмы крови птиц (, ) Группы птиц на 3-й день после вакцинации 1723,002602,0029,182,61 296,0012,08 86,52 320,23 1 группа 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-30,05 1-30,05 1-30,01 1-30,05 1917,502746,5028,951,97 308,5029,78 2 группа 158,71 430,90 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 1547,502425,753 группа 24,512,10 276,2510,96 85,67 616,01 на 7-й день после вакцинации 1582,002604,0028,732,60 326,5014,05 210,68 272,47 1 группа 0,050,050,050,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 1713,252725,0026,982,42 331,5020,51 176,12 125,00 2 группа 0,050,050,050,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 1386,002547,0025,752,27 308,0023,31 3 группа 190,73 264,330,050,050,050,05 на 14-й день после вакцинации 1433,253128,7530,030,93 293,0017,13 186,80 73,03 1 группа 0,050,050,050,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-20,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 1-30,05 1515,753282,5031,212,31 311,0012,08 65,45 591,86 2 группа 0,050,050,050,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 2-30,05 1412,753014,5027,581,15 275,7515,17 3 группа 139,05 454,500,050,050,050,05 Примечание 1 группа - иммунизированы вакциной, приготовленной с использованием нового адъюванта (минеральное масло 52 натрия тиосульфат) 2 группа - иммунизированы вакциной, приготовленной с использованием минерального масла 52 (без натрия тиосульфата) 3 группа - контроль (интактная птица) 1-2 - 1-2 группы 1-3 - 1-3 группы 2-3 - 2-3 группы- по сравнению с предыдущим сроком исследований. 6 14134 1 2011.02.28 Иммунизация ремонтного молодняка кур против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита, инфекционной бурсальной болезни и инфекционного ларинготрахеита жидкой инактивированной вакциной, приготовленной с использованием нового адъюванта,обеспечивает, по сравнению с применением прототипа, значительное повышение уровня специфических противовирусных антител (табл. 5). Таблица 5 Напряженность поствакцинального иммунитета у птиц Титры специфических антител к вирусу ньюк вирусу инк вирусу инк вирусу инкаслской фекционного фекционной фекционного болезни Группы птиц бронхита (в бурсальной ларинготрахе(в реакции реакции болезни (в ре- ита (в иммуторможения нейтрализаакции имму- ноферментном гемагглютинации) нодиффузии) анализе) ции) до вакцинации фоновые показатели 2,1-3,3 2 1,21,2 2 1,1 2 на 28-й день после вакцинации Иммунизированы вакциной, приготовленной с использованием нового 6,0 2 2,73,5 2 2,4 2 адъюванта (минеральное масло 52 натрия тиосульфат) Иммунизированы вакциной, приготовленной с использованием в каче 5,8 2 2,43,2 2 2,0 2 стве адъюванта минерального масла 52 Контрольная группа (ин 2,2 2 1,31,1 2 1,0 2 тактная птица) Источники информации 1. ТУ 600049853.073 - 2007. Вакцина инактивированная эмульгированная против Ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, инфекционной бурсальной болезни и инфекционного ларинготрахеита птиц утверждены ГУВ Минсельхозпрода Республики Беларусь 15.01.2007. 2. Лях, А.Л. Влияние иммуностимулятора натрия тиосульфата на иммуноморфогенез при парентеральной вакцинации гусят против пастереллеза Автореф. дис канд. вет. наук. - Витебск, 2003. - 21 с. 3. Прибытько, С.П. Влияние иммуностимулятора натрия тиосульфата на иммуноморфогенез у цыплят, вакцинированных против болезни Марека Автореф. дис канд. вет. наук. - Витебск, 1998. - 18 с. 14134 1 2011.02.28 4. Прудников, В.С. Иммуноморфогенез у животных, перорально вакцинированных против сальмонеллеза, и влияние на него иммуностимуляторов Автореф. дис д-ра вет. наук 16.00.02 / В.С. Прудников Ленингр. вет. ин-т. - Ленинград, 1991. - 36 с. 5. Сергеев В.О. Вирусные вакцины. - Киев Урожай, 1993. - С. 174-193. 6.1604685 А 2, 2005. 7.01362270 С, 1994. 8.02184566 С 1,2002. 9.5562910 А, 1996. 10.09522989 А 1, 1995. 11.2005089262 А 2, 2005. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8