Способ определения стимулирующего или ингибирующего действия растительного экстракта на рост тест-штамма бактерий семейства Enterococcaceae

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТИМУЛИРУЮЩЕГО ИЛИ ИНГИБИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО ЭКСТРАКТА НА РОСТ ТЕСТ-ШТАММА БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(72) Авторы Дудчик Наталья Владимировна Филонов Валерий Петрович Колядич Елена Сергеевна Мельникова Людмила Александровна Лилишенцева Анна Николаевна Иващенко Наталья Ивановна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(56)-... 2001. - . 49. - о. 1. - . 183-188. Микробиология. Методические рекомендации к лабораторным занятиям,контроль самостоятельной работы студентов. - Минск, 2002. - С. 3-5, 45, 4950, 53. БЕЛОДЕД А.В. Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты бактериями р Автореферат диссертации. - М., 2008. С. 6, 8. САКОВИЧ Г.С. и др. Физиология и количественный учет микроорганизмов. Учебное электронное текстовое издание. - Екатеринбург ГОУ ВПО УГТУ-УПИ, 2005. - С. 2-11.(57) Способ определения стимулирующего или ингибирующего действия растительного экстракта на рост тест-штамма бактерий семейства , заключающийся в том, что культивируют тест-штамм при температуре 30-37 С в жидкой питательной среде, в которую внесен растительный экстракт, а также в жидкой питательной среде, в которую внесен экстрагент, каждый час измеряя оптическую плотность бактериальных суспензий при длине волны 540 нм до достижения ее максимального значения, соответствующего наступлению стационарной фазы роста тест-штамма, после чего рассчитывают отношение М оптической плотности бактериальной суспензии в стационарной фазе роста тест-штамма в питательной среде с растительным экстрактом к оптической плотности бактериальной суспензии в стационарной фазе роста тест-штамма в питательной среде с экстрагентом, и при М равном единице судят о том, что растительный экстракт не оказывает стимулирующего или ингибирующего действия на рост тест-штамма, при М больше единицы оказывает стимулирующее, а при М меньше единицы оказывает ингибирующее действие на рост тест-штамма, при этом в качестве питательной среды используют среду с 7,0-7,4, содержащую, г/л сернокислый аммоний 1,50,1 магний сернокислый семиводный 0,10,1 калий фосфорнокислый однозамещенный 7,00,1 14974 1 2011.10.30 калий фосфорнокислый двузамещенный натрий хлористый цитрат железа глюкоза дрожжевой экстракт вода Изобретение относится к разделу гигиены питания, санитарной микробиологии и фармакологии. Известен способ оценки антимикробной активности растительных экстрактовс использованием тест-культур бактерий, заключающийся в том, что в центр поверхности засеянного тест-штаммами микроорганизмов питательного агара располагают диски из стерильной фильтровальной бумаги, предварительно импрегнированные растительным экстрактом, растирают поверхность питательного агара стеклянным шпателем, а затем чашки с посевами микроорганизмов инкубируют в термостате. После инкубации с помощью кронциркуля измеряют диаметр зоны просветления и выражают в мм диаметр зоны ингибирования роста микроорганизмов. Однако способ-прототип обладает низкой воспроизводимостью и чувствительностью,в связи с чем требуется длительное, до 24 ч, время проведения испытаний, и не дает возможности оценить стимулирующее воздействие растительных экстрактов на микроорганизмы. Кроме того, эффект воздействия экстракта на тест-культуру в значительной степени определяется способностью экстракта диффундировать в агар, что может исказить результаты. Общими признаками для заявляемого способа и прототипа является то, что осуществляют параллельное внесение растительных экстрактов в питательную среду, содержащую ранее определенную концентрацию бактериальной тест-культуры, и проводят их совместное культивирование в термостате с последующей обработкой полученных данных. Задачей заявленного изобретения является повышение воспроизводимости и чувствительности способа. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ определения стимулирующего или ингибирующего действия растительного экстракта на рост тест-штамма бактерий семейства , при этом культивируют тест-штамм при температуре 30-37 в жидкой питательной среде, в которую внесен растительный экстракт, а также в жидкой питательной среде, в которую внесен экстрагент, каждый час измеряя оптическую плотность бактериальных суспензий при длине волны 540 нм до достижения ее максимального значения, соответствующего наступлению стационарной фазы роста тест-штамма, после чего рассчитывают отношениеоптической плотности бактериальной суспензии в стационарной фазе роста тестштамма в питательной среде с растительным экстрактом к оптической плотности бактериальной суспензии в стационарной фазе роста тест-штамма в питательной среде с экстрагентом, и приравном единице судят о том, что растительный экстракт не оказывает стимулирующего или ингибирующего действия на рост тест-штамма, при м больше единицы - оказывает стимулирующее, а применьше единицы - оказывает ингибирующее действие на рост тест-штамма, при этом в качестве питательной среды используют среду с 7,0-7,4, содержащую, г/л сернокислый аммоний 1,50,1 магний сернокислый семиводный 0,10,1 калий фосфорнокислый однозамещенный 7,00,1 калий фосфорнокислый двузамещенный 7,00,1 натрий хлористый 2,00,1 2 14974 1 2011.10.30 цитрат железа 0,010,005 глюкоза 5,00,5 дрожжевой экстракт 2,00,5 вода остальное. Мы исходили из того, что рост микроорганизмов на питательной среде имеет, как правило, несколько фазлаг-фазу, выраженную фазу быстрого роста культуры (логарифмическую фазу), фазу замедления роста, стационарную фазу и фазу отмирания. Стационарная фаза роста характеризуется максимальным накоплением биомассы культуры. Поэтому для оценки модулирующей активности водных экстрактов растений целесообразно выбрать стационарную фазу роста, а накопление биомассы оценивать по оптическим показателям в жидкой питательной среде. Для этой цели был оптимизирован состав среды культивирования. Питательный состав должен быть сбалансирован таким образом,чтобы обеспечить нормальное развитие тест-микроорганизма, но при этом не должен маскировать как ингибирующее, так и стимулирующее действие растительных экстрактов. Кроме того, среда должна быть прозрачна, бесцветна (или слегка окрашена). Согласно нашим исследованиям, такими свойствами обычно обладают синтетические или полусинтетические питательные среды. Такой прием позволяет повысить чувствительность и воспроизводимость способа за счет того, что осуществляется регистрация оптической плотности клеточной суспензии в стационарной фазе развития роста тест-штамма в питательной среде, содержащей и не содержащей испытуемого образца. В качестве тест-культуры используют грамположительные кокковидные бактерии семейства(роды , , и другие роды). Пример. Требуется определить модулирующее действие экстрактов пряноароматических и лекарственных растений. В качестве бактериальных тест-штаммов используют кокковидные грамположительные бактерии 6538,29212,9341, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Используемые штаммы являются типичными по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам. Для приготовления рабочих культур производят отсев бактериальных тест-штаммов на косяки мясопептонного агара, содержащего 0,1 глюкозы и 0,2 дрожжевого экстракта, и инкубируют в термостате при (371)в течение 18-24 ч. Смывы с косяков производят стерильным 0,85 -ным физиологическим раствором. Концентрацию клеток доводят до 109 КОЕ/см 3, используют оптический стандарт мутности на 10 ед. Состав среды культивирования, г/л сернокислый аммоний - 1,50,1, магний сернокислый семиводный - 0,10,1, калий фосфорнокислый однозамещенный - 7,00,1, калий фосфорнокислый двузамещенный - 7,00,1, натрий хлористый - 2,00,1, цитрат железа 0,010,005, глюкоза - 5,00,5, дрожжевой экстракт - 2,00,5,7,0-7,4. В пробирки объемом 50 см 2 с 10 см 3 среды культивирования указанного состава вносят 3 объемныхсуспензии микроорганизмов с начальной концентрацией 109 КОЕ/см 3. Для оценки действия экстрактов в пробирки с питательной средой добавляют 5 объемныхводных экстрактов. Контролем служит питательная среда с внесенными суспензией микроорганизмов и равным объемом растворителя, но без добавления экстрактов растений. Культивируют при оптимальной для данных микроорганизмов температуре 3037 в течение 18-24 ч до достижения стационарной фазы роста. Во время проведения эксперимента проводят измерения оптической плотности культуры. Пробы отбирают в количестве 2 см в начале опыта и через каждые 1 час, соблюдая правила асептики. Измерения проводят не менее чем в трех повторностях для каждого экстракта и композиции на 3 14974 1 2011.10.30 спектрофотоколориметре при длине волны 540 нм, длина оптического пути составляет 1 см. Получены следующие результаты (таблица). Результаты оценки модулирующего действия растительных экстрактов на бактериальные тест-штаммы Экстракт 1 2 Действие 6538 Экстракт 1 0,72 0,12 0,17 Ингибирующее Экстракт 2 0,72 0,10 0,14 Ингибирующее Экстракт 3 0,72 0,76 1,1 Стимулирующее 29212 Экстракт 1 0,57 0,43 0,75 Ингибирующее Экстракт 2 0,57 0,65 1,1 Стимулирующее Не обладает модулирующим Экстракт 3 0,57 0,57 1,0 действием 9341 Экстракт 1 0,44 0,24 0,54 Ингибирующее Экстракт 2 0,44 0,32 0,73 Ингибирующее Экстракт 3 0,44 0,56 1,3 Стимулирующее Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа заключается в количественной оценке действия растительных экстрактов на тест-штаммы бактерий, в более простой пробоподготовке, т.к. отсутствует стадия импрегнирования растительным экстрактом стерильного бумажного диска, а также в исключении влияния скорости диффузии экстракта в агар на результаты определения. Источники информации 1. , ., ,//. .. - 2001. - . 49. - о. 1. - . 183-188 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4