Способ оценки антибактериальной активности растительного экстракта

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ РАСТИТЕЛЬНОГО ЭКСТРАКТА(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(72) Авторы Дудчик Наталья Владимировна Филонов Валерий Петрович Колядич Елена Сергеевна Мельникова Людмила Александровна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(56).., 1999. . 28. - . 145-147. ФАУСТОВА Н.М. и др. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. -3. - . 3-7. ДУДЧИК Н.В. и др. Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. Материалы Международной конференции. Минск, 2004. - . 199-201.2189040 2, 2002.2298170 2, 2007.2240556 2, 2004.2289132 1, 2006.1781610 1, 1992.26942 , 2007.(57) Способ оценки антибактериальной активности растительного экстракта, включающий внесение экстракта в питательную среду, содержащую бактериальную тест-культуру в определенной концентрации, и культивирование тест-культуры, отличающийся тем, что используют питательную среду, содержащую 5,0 г пептона, 2,0 г дрожжевого экстракта,1,0 г глюкозы, 2,0 г натрия хлористого, 1,5 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,75 г калия фосфорнокислого двузамещенного и воду дистиллированную до 1000 мл, в качестве тест-культуры используют штаммы сапрофитных, санитарно-показательных, патогенных,условно-патогенных или индикаторных бактерий в концентрации 1107-1108 клеток/мл,осуществляют культивирование тест-культуры параллельно в питательной среде без растительного экстракта и в среде, содержащей экстракт в последовательно увеличивающихся концентрациях, в измерительных ячейках микробиологического анализатора при температуре 28-37 С с одновременной импедиметрической регистрацией показателей для определения времени детекциироста бактериальной тест-культуры, при увеличении значенияроста бактериальной тест-культуры в питательной среде с растительным экстрактом по сравнению сроста бактериальной тест-культуры в питательной среде без растительного экстракта в 1,5 раза определяют показатель 50, соответствующий концентрации растительного экстракта, при которой ингибируется рост бактериальной тесткультуры на 50 , и при значении 50, равном 1-5 , антибактериальную активность растительного экстракта оценивают как выраженную, при значении 50, равном 6-30 , как среднюю, а при значении 50 свыше 30- как слабую. 13118 1 2010.04.30 Изобретение относится к разделу гигиены питания, санитарной микробиологии и фармакологии. Известен способ оценки антибактериальной активности растительных экстрактовс использованием тест-культур фитопатогенных бактерий,заключающийся в том, что в лунки на поверхности засеянного тест-штаммами микроорганизмов питательного агара вносят водные растительные экстракты, посевы инкубируют в термостате при 24 С в течение 24 ч и оценивают антибактериальную активность путем измерения диаметра зоны подавления роста тест-штаммов 1. Однако способ-прототип обладает следующими недостатками низкой чувствительностью, в связи с чем требуется длительное (до 24 ч) время проведения испытаний, полуколичественным характером измерений антибактериальной активности растительных экстрактов, а также отсутствием характеристик оценки степени антибактериальной активности. Общими признаками для заявляемого способа и прототипа является то, что осуществляют параллельное внесение растительных экстрактов в разных концентрациях в питательную среду, содержащую ранее определенную концентрацию бактериальной тест-культуры, и проводят их совместное культивирование с последующей обработкой полученных данных. Задачей заявленного изобретения является повышение чувствительности способа и сокращение времени тестирования за счет определения электрохимических показателей питательной среды, увеличение числа бактериальных тест-культур для оценки антибактериальной активности. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ оценки антибактериальной активности растительного экстракта,включающий внесение экстракта в питательную среду, содержащую бактериальную тесткультуру в определенной концентрации, и культивирование тест-культуры, при этом используют питательную среду, содержащую 5,0 г пептона, 2,0 г дрожжевого экстракта, 1,0 г глюкозы, 2,0 г натрия хлористого, 1,5 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,75 г калия фосфорнокислого двузамещенного и воду дистиллированную до 1000 мл, в качестве тест-культур используют штаммы сапрофитных, санитарно-показательных, патогенных,условно-патогенных или индикаторных бактерий в концентрации 1107-1108 клеток/мл,осуществляют культивирование тест-культуры параллельно в питательной среде без растительного экстракта и в среде, содержащей экстракт в последовательно увеличивающихся концентрациях, в измерительных ячейках микробиологического анализатора при температуре 28-37 С с одновременной импедиметрической регистрацией показателей для определения детекциироста бактериальной тест-культуры, при увеличении значенияроста бактериальной тест-культуры в питательной среде с растительным экстрактом по сравнению сроста бактериальной культуры в питательной среде без растительного экстракта в 1,5 раза определяют показатель 50, соответствующий концентрации растительного экстракта, при которой ингибируется рост бактериальной культуры на 50 , и при значении 50, равном 1-5 , антибактериальную активность растительного экстракта оценивают как выраженную, при значении 50, равном 6-30 , как среднюю, а при значении 50 свыше 30- как слабую. Для оценки степени антибактериальной активности предложен показатель 50 - такая концентрация растительного экстракта, которая ингибирует рост бактериальной тесткультуры на 50 . Предложены также количественные параметры показателя 50 для оценки степени антибактериальной активности растительных экстрактов. При этом в заявленном способе могут быть использованы в качестве тест-культур сапрофитные, санитарно-показательные, патогенные, условно-патогенные, индикаторные бактерии. Штаммы могут быть получены из государственных музеев и коллекций, а также могут быть выделены в виде изолятов в ходе микробиологических исследований. Оценка роста тест-культур бактерий по изменению электрохимических показателей среды указанного состава позволяет повысить чувствительность способа за счет того, что 2 13118 1 2010.04.30 осуществляется импедиметрическая регистрация электрохимических изменений питательной среды, а это позволяет провести детекцию роста бактериальной тест-культуры в течение 2-10 ч, а также увеличить число бактериальных тест-культур при проведении анализа. Примеры выполнения. Пример 1. Требуется определить 50 для растительного экстракта 1. В качестве тест-культур используют санитарно-показательную грамотрицательную бактерию 8739 и сапрофитную почвенную бактериюБИМ В-6. Тест-штаммполучен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Тест-штаммБИМ В-6 получен из Национальной коллекции непатогенных микроорганизмов (научная коллекция типовых и промышленно-ценных микроорганизмов) Института микробиологии НАН Беларуси. Штаммы являются типичными по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам. Тест-штаммы хранят при температуре (51) С под слоем стерильного вазелинового масла на среде Романова. Для приготовления рабочих культур тест-штаммы культивируют в термостате на среде указанного состава, в которую добавляют агар до 2 . Режимы культивирования при(282) С дляБИМ В-6 в течение 48 ч и при (352) С для 8739 в течение 24 ч. Смывы проводят фосфатным буферным раствором с 0,1 пептоном,7,0, используя стандарт мутности на 10 единиц мутности. Содержание клеток тест-штамма в инокуляте доводили до 108 КОЕ/мл. Подтверждение содержания клеток в рабочей культуре проводят путем высева на среду приведенного состава, в которую добавляют агар до 2 . В качестве питательной среды при проведении исследования используют среду следующего состава (на 1000,0 мл дистиллированной воды) пептон 5,0 г дрожжевой экстракт 2,0 г глюкоза 10,0 г натрий хлористый 2,0 г калий фосфорнокислый однозамещенный 1,5 г калий фосфорнокислый двузамещенный 0,75 г 7,2-7,4. Стерилизация 121 С в течение 20 мин. Приготовленную среду инокулируют параллельно тест-штаммом 8739 и тест-штаммомБИМ В-6 до конечной концентрации 1107-1108 клеток/мл, разливают в измерительные ячейки анализатора, вносят исследуемый растительный экстракт в последовательно увеличивающихся концентрациях и инкубируют в термоинкубаторе в течение 10-12 ч. Режимы инкубирования при (282) С дляБИМ В-6 и при (352) С для 8739 в течение 24 ч. Получены следующие результаты. Время детекции роста тест-культуры(без исследуемого экстракта) составляет для 8739 - 2,2 ч, дляБИМ В-6 - 6,0 ч. Для экстракта 1 в последовательно увеличивающихся концентрациях время детекции составляет Таблица 18739 БИМ В-6 концентрация 0,9- 2,2 ч концентрация 0,9- 6,2 ч концентрация 1,8- 2,8 ч концентрация 1,8- 7,8 ч концентрация 2,7- 3,3 ч концентрация 2,7- 9,0 ч концентрация 3,6- 4,1 ч концентрация 3,6- 11,1 ч. 3 13118 1 2010.04.30 Таким образом, при внесении в среду экстракта 1 в концентрации 2,7 время детекции тест-культурывозросло с 2,2 до 3,3 ч, а тест-культурыБИМ В-6 возросло с 6,0 до 9,0 ч, т.е. увеличилось на 50 . Поэтому 50 для экстракта 1 составляет 2,7 для обеих тест-культур. Согласно предложенным критериям оценки, растительный экстракт 1 проявляет выраженную антибактериальную активность в отношении 8739 иБИМ В-6, т.к. концентрация 2,7 привела к 50 ингибированию роста культур. Пример 2. Требуется определить 50 для растительного экстракта 2. В качестве тест-культур используют санитарно-показательную грамположительную бактерию 25923 и сапрофитную почвенную бактериюБИМ В-6. Тест-штамм 25923 получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Тест-штаммБИМ В-6 получен из Национальной коллекции непатогенных микроорганизмов (научная коллекция типовых и промышленно-ценных микроорганизмов) Института микробиологии НАН Беларуси. Штаммы являются типичными по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам. Тест-штаммы хранят при температуре (51) С под слоем стерильного вазелинового масла на среде Романова. Пробоподготовку и проведение анализа проводят по методике, описанной в п. 1 раздела Примеры выполнения. Получены следующие результаты. Время детекции роста тест-культуры(без исследуемого экстракта) составляет для 25923 - 2,5 ч, дляБИМ В-6 - 6,0 ч. Для экстракта 2 в последовательно увеличивающихся концентрациях время детекции составляет Таблица 2 БИМ В-6 концентрация 30- 6,0 ч концентрация 60- 2,2 ч концентрация 90- 9,0 ч Таким образом, при внесении в среду экстракта 2 в концентрации 30-90 время детекции тест-культуры 25923 возросло с 2,2 до 3,3 ч при внесении концентрации 60 . Время детекции тест-культурыБИМ В-6 возросло с 6,0 до 9,0 ч для концентрации 90 , т.е. увеличилось на 50 . Поэтому 50 для экстракта 2 составляет 5060 в отношении 25923 и 5090 дляБИМ В-6. Согласно предложенным критериям оценки, растительный экстракт 2 проявляет слабую антибактериальную активность в отношении 25923 иБИМ В-6, т.к. только 60 и 90 этой композиции привели к 50 ингибированию роста культур. Параллельно было проведено определение антибактериальной активности для экстрактов 1 и 2 по способу-прототипу. Получены следующие результаты. Для определения антибактериальной активности экстрактов 1 и 2 потребовалось 24 ч. Размер зон ингибирования (в мм) приведен в табл. 3. 4 Показатели 50 для экстрактов 1 и 2 не были определены, т.к. способ-прототип не предусматривает такого измерения. Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа заключается в увеличении чувствительности, уменьшении времени тестирования с 24 до 2,2-9,0 ч, что дает основание рекомендовать его в качестве экспресс-метода, а также увеличении числа тест-культур для определения показателя антибактериальной активности 50, а также дает возможность оценить степень антибактериальной активности растительных экстрактов. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5