Способ диагностики рассеянного склероза

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА(71) Заявитель Белорусский государственный институт усовершенствования врачей(73) Патентообладатель Белорусский государственный институт усовершенствования врачей(57) Способ диагностики рассеянного склероза путем исследования компонентов крови, отличающийся тем,что определяют радиометрически-биологическим методом миелинотоксическую активность сыворотки крови больного, воздействующую на распад миелина в головном и спинном мозге, и иммунный ответ организма на него, и при повышении миелинотоксической активности сыворотки крови больного до 6,4-8,8 условных единиц (усл. ед.), а также уменьшении в крови содержания Т-хелперов (СД 4) до 32,26-35,54 , Тсупрессоров (СД 8) до 11,8-15,0 , Т-лимфоцитов до 56,24-59,16 и повышении В-лимфоцитов (СД 22) до 28,35-28,65 , циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) до 87,74-94,58 оптических единиц (оп. ед.) определяют 1-ю стадию низкой активности демиелинизирующего процесса при повышении миелинотоксической активности сыворотки крови до 21,24-22,96 усл. ед., а также снижении Т-лимфоцитов (Е-РОК) до 52,76-55,04 , СД 22 до 15,42-16,58 , СД 4 до 24,41-26,99 и повышении СД 8 до 30,3-32,5 , ЦИК до 80,46-88,22 оп. ед. определяют 2-ю стадию умеренно выраженной активности демиелинизирующего процесса при повышении миелинотоксической активности сыворотки крови до 38,9-41,3 усл. ед., а также повышении СД 4 до 33,17-36,83 , интерлейкинов (ИЛ-2 Р) до 15,9-17,3 , иммуноглобулиновдо 14,3-16,3 г/л, - д 2,35-2,79 г/л,до 2,26-2,56 г/л, ЦИК до 91,55-97,75 оп. ед. определяют 3-ю стадию высокой активности демиелинизирующего процесса - подострый процесс, и при повышении миелинотоксической активности сыворотки крови до 74,86-83,74 усл. ед, а также высоком содержании ЦИК 101,97-108,75 оп. ед.,снижении СД 8 до 16,8-19,8 определяют 4-ю стадию очень высокой активности демиелинизации - острый процесс.(56)2007714 1, 1994. Петров , Хаитов , Пинетин Б.В. Оценка иммунного статуса человека в норме и патологии // Иммунология.1994. -6. - С. 6-9. Филиппович Н.Ф. и др. Диагностические возможности метода количественной оценки продуктов распада миелина в крови // Достижения медицинской науки Беларуси. - Мн. - 1997. - . 2. - С. 131-132. Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике рассеянного склероза . Известен метод диагностики , основанный на свойстве иммунной системы больныхне реагировать на вводимый серотонин 1. Он дает возможность констатировать наличие , однако не позволяет определить стадию длительно (десятки лет) протекающего заболевания, оценить динамику, изменения активности процесса на протяжении всего курса лечения. Задача изобретения - определение стадии активности рассеянного склероза у больных. Предлагаемый способ диагностики основан на характерном только для больныхтоксическом действии их сыворотки на длительно растущие культуры мозжечка с миелинизированными нервными волокнами. Поставленная задача решается следующим образом предложен способ диагностикипутем исследования компонентов крови, в котором определяют радиометрически-биологическим методом миелинотоксиче 3882 1 скую активность сыворотки крови больного и иммунный ответ организма на него и при повышении миелинотоксической активности сыворотки крови больного до 6,4-8,8 условных единиц (усл. ед.) (группа доноров 3,16-4,80 от усл.ед.), а также уменьшении в крови содержания Т-хелперов (СД 4) до 32,26-35,54 , Тсупрессоров (СД 8) до 11,8-15,0 , Т-лимфоцитов до 56,24-59,16 и повышении В-лимфоцитов (СД 22) до 28,35-28,65 , циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) до 87,74-94,58 оптических единиц (оп. ед.) определяют 1-ю стадию низкой активности демиелинизирующего процесса при повышении миелинотоксической активности сыворотки крови до 21,24-22,96 усл. ед., а также снижении Т-лимфоцитов (Е-РОК) до 52,76-55,04 , СД 22 до 15,42-16,58 , СД 4 до 24,47-26,99 и повышении СД 8 до 30,3-32,5 , ЦИК до 80,40-88,22 оп. ед. определяют 2-ю стадию умеренно выраженной активности демиелинизирующего процесса при повышении миелинотоксической активности сыворотки крови до 38,9-41,3 усл.ед., а также повышении СД 8 до 33,17-36,83 , интерлейкинов (ИЛ-2 Р) до 15,9-17,3 , иммуноглобулиновдо 14,3-16,3 г/л,до 2,35-2,79 г/л,до 2,26-2,56 г/л, ЦИК до 91,55-97,75 оп. ед. определяют 3-ю стадию высокой активности демиелинизирующего процесса, т.е. подострый процесс, и при получении миелинотоксической активности сыворотки крови 74,86-83,74 усл.ед., а также высоком содержании ЦИК (101,97-108,75 оп. ед.),снижении СД 8 до 16,8-19,8 определяют 4-ю стадию очень высокой активности демиелинизации, т.е. острый процесс. Способ осуществляют следующим образом. Кровь из локтевой вены забирают в стерильную бактериологическую пробирку в количестве 5 мл, освобождают от кровяного сгустка и центрифугируют - 15 мин при 2000 об./мин. Полученную сыворотку отсасывают грушей в стерильные пробирки, закрывают ватно-марлевыми пробками, не прогревая их с целью сохранения собственного комплемента, что позволяет выявить максимальный миелинотоксический эффект. Замороженные сыворотки могут храниться до 2 месяцев. В качестве контроля используют сыворотки здоровых людей, прогретые при 56 С для инактивации комплемента, которые не дают токсического эффекта в культурах нервной ткани. Эти сыворотки постоянно используют в качестве контроля во всех исследованиях миелинотоксических свойств испытуемых сывороток больных людей. Исследование каждой партии сывороток сопровождают изучением двух сывороток заведомо положительной больного и заведомо отрицательной от здорового донора. Указанные контрольные сыворотки хранятся в замороженном состоянии и своевременно возобновляются. При подготовке культуры нервной ткани материал для культивирования получают от взрослых крыс любого пола массой 150-200 г. Из головного мозга одной крысы может быть подготовлено 240 эксплантатов,которые идут на исследование 19 сывороток больных и одной контрольной. Каждую сыворотку тестируют на 12 эксплантатах в двух флаконах. Крыс умерщвляют эфиром, удаляют кровь, а затем обнажают и вскрывают черепную коробку, извлекают головной мозг, помещают в лунку камеры Максимова с питательной средой (без сыворотки), насыщенную смесью кислорода (96 ) и углекислым газом (5 ). Затем удаляют мягкие мозговые оболочки. Кору больших полушарий глазным скальпелем отсекают от белого подкоркового вещества и перекладывают на резиновую пластинку, смоченную питательной средой. Взятые участки мозга разрезают на несколько продольных полос шириной в 1 мм и с помощью устройства для дозированного забора мозговой ткани 3 отделяют от каждой полоски кусочки объемом в 1 мм 3, засасывают в пипетку и переносят в пенициллиновые флаконы с заранее приготовленной питательной средой, содержащей, кроме того, сыворотки больных или здоровых людей. В каждый флакон помещают по 6 эксплантатов нервной ткани, в питательную среду добавляют меченый холестерин и аэрируют смесью газов (52 и 952) через пастеровскую пипетку, соединенную с баллоном, содержащим смесь газов. Питательная среда среда Игла-50 , глюкоза до конечной концентрации 600 мг на 100 мл среды, глютамин из расчета 1 мл 3 раствора на 100 мл среды, испытуемая сыворотка - 50 . Постановку основного теста проводят следующим образом. 20 флаконов с эксплантатами устанавливают в штативе в один ряд. Во все сосуды одной пипеткой вносят по 0,4 мл питательной среды. К 18 флаконам отдельными пипетками добавляют по 0,5 мл испытуемой сыворотки. В двух последних флаконах в качестве контроля используют сыворотки здоровых людей, инактивированные при 56 С. В каждый флакон с культурами добавляют по 0,1 мл рабочего раствора 3 Н-холестерина до конечной концентрации 1 микрокюри/мл. Флаконы закрывают резиновыми пробками и помещают в термостат при 37 С на 18 ч. По окончании инкубации эксплантаты извлекают пипеткой на сухую фильтровальную бумагу, а жидкость из флаконов сливают в специальную емкость. Бумагу с культурами помещают в ванночку с физиологическим раствором, который дважды меняют в течение часа для отмывания эксплантатов от невключившегося изотопа. Затем бумагу высушивают, разрезают на равные квадраты (длина сторон по 0,5 см) таким образом,чтобы культивируемый фрагмент нервной ткани располагался в центре квадрата. Бумажный квадрат помещают в отдельный сцинтилляционный флакон кусочком ткани кверху, в который наливают сцинтилляционную жидкость по 0,5 мл. В каждой пробе измеряют радиоактивность. 2 3882 1 Определение демиелинизирующих свойств сывороток больныхпроизводят по следующей схеме 1 сутки взятие крови больного, приготовление сывороток крови приготовление культур головного мозга взрослых крыс, питательных сред и рабочего раствора холестерина постановка основного этапа исследования с инкубацией эксплантатов с меченным холестерином в присутствии испытуемой сыворотки. 2 сутки обработка культур, радиометрический анализ и учет результатов исследования. Количественную оценку миелинотоксического действия сывороток больныхпроводят на основании разницы показателей включения изотопа в контрольные культуры (культуры, инкубируемые с эталонными сыворотками здоровых людей) и в испытуемые культуры (культуры, инкубируемые о сыворотками больных людей). Миелинотоксический эффект (МТЭ) вычисляют, определяя отношение суммарных радиоактивностей в тканях культур опыта ( оп) к сумме радиоактивностей в тканях культур, использованных в качестве контроля (эксплантаты, инкубируемые с контрольными гретыми до 56 С сыворотками) ( К). Для каждой партии сывороток ставят свой контроль. Суммарную радиоактивность контрольных сывороток принимают за 100 . При расчетах с целью перевода в условные единицы (усл. ед.) от полученной суммы радиоактивностей испытуемой и контрольной сывороток отнимают сумму радиоактивностей контрольной сыворотки. Результаты исследования в усл. ед. соответствуют проценту подавления или стимуляции включения меченного холестерина. Что касается многочисленных иммунологических показателей, то они оценивались нами у больныхи доноров по общепринятым методам 2 и сопоставлялись с результатами количественной оценки миелинотоксической активности сыворотки. Результаты исследования приведены в табл. 1-4. Пример 1. Больная ., 29 лет, поступила в неврологическое отделение 19 октября 1994 г. с жалобами на слабость в ногах, пошатывание при ходьбе, головокружение, двоение при взгляде вниз, снижение зрения, периодическое недержание мочи. Из анамнеза известно, что больна с 1992 г., течение заболевания ремиттирующее, обострения были в 1992 и 1993 гг. При осмотре отмечено патологии со стороны внутренних органов нет. Пульс - 72 уд./мин, АД 125/70 мм рт. т. Неврологически горизонтальный нистагм в обе стороны с ротаторным компонентом, речь дизартричная. Умеренный спастический тетрапарез с патологическими рефлексами. Умеренно выраженная статическая и динамическая атаксия, ходит без посторонней помощи. Анализы мочи и крови без патологии. На обзорной краниограмме патологии нет. ЯМР-томография головного мозга полушария равновелики,борозды расширены. Желудочки симметричны, умеренно расширены. Срединные структуры не смещены. В белом веществе обоих полушарий, в основном перивентрикулярно, визуализируются множественные очаги от 3 до 15 мм ярко гиперинтенсивные в -2 и слабо гипоинтенсивные в -1 режимах. Аналогичные, но более мелкие очаги обнаружены в веществе моста, обеих ножках мозга, правом полушарии мозжечка. Заключение описанные очаговые изменения можно трактовать как проявления демиелинизирующего заболевания с наружной и внутренней гидроцефалией. Глазное дно - битемпоральная бледность дисков зрительных нервов. Установлен клинический диагноз Рассеянный склероз, цереброспинальная форма, прогредиентноремиссирующее течение, период обострения,степень тяжести (по двигательному дефекту). Для объективизации стадии активностиопределялись иммунологические показатели и миелинотоксическая активность сыворотки крови МТЭ Миелинотоксическая активность сыворотки крови оказалась умеренно повышенной (22,3 усл. ед) при снижении Т-лимфоцитов крови до 40 , СД 22 до 16 , СД 4 до 26,2 , СД 8 до 3,4 , ЦИК до 84,2 оп. ед. С учетом полученных данных выставлен заключительный клинический диагноз рассеянный склероз, цереброспинальная форма, прогредиентно-ремиттирующее течение, период обострения с умеренно выраженной( стадия) активностью процесса,степень тяжести (по двигательному дефекту). Пример 2. Больная Т., 35 лет, поступила в клинику 4 ноября 1994 г. с жалобами на слабость в ногах, пошатывание при ходьбе, головокружение, снижение зрения. Больна в течение трех лет, когда стала отмечать нарастаю 3 3882 1 щую слабость в ногах, пошатывание при ходьбе, снижение зрения, периодически двоение. При осмотре патологии со стороны внутренних органов не выявлено. Пульс 78 уд. мин АД 130/75 мм рт. ст. Неврологически легкая эйфория. Горизонтальный нистагм в обе стороны, больше влево. Умеренный спастический тетрапарез с патологическими рефлексами, ходит без посторонней помощи. Интенционный тремор с двух сторон при выполнении пальце-носовой и коленно-пяточной проб. Не устойчива в позе Ромберга. На краниограммах патологии нет. На ЯМР-томограммах головного мозга полушария равновелики, умеренно расширены борозды, сильвиевы щели с обеих сторон, межполушарная щель, цистерны основания мозга. Желудочки умеренно расширены, симметричны. Срединные структуры мозга не смещены. В белом веществе мозга визуализируются единичные, а также перивентрикулярные множественные очаги от 3 до 12 мм гипоинтенсивные в -1 и гиперинтенсивные в -2 режимах. Аналогичные единичные очаги определяются в области подкорковых узлов и ножках мозга с обеих сторон. Заключение описанные очаговые изменения можно трактовать как множественные легкие очаги демиелинизации с наружной и внутренней гидроцефалией. Глазное дно - битемпоральная бледность дисков зрительных нервов с обеих сторон, деколорация височных половин. Установлен клинический диагноз рассеянный склероз, цереброспинальная форма, прогредиентное течение,ст. тяжести (по двигательному дефекту). Для оценки степени активности демиелинизирующего процесса изучались иммунологические показатели и миелинотоксическая активность сыворотки кровиоп 0,8284 МТЭ 100100141,610041,6 усл. ед. 0,5850 Она оказалась высокой при повышении иммунологических показателей СД 8 (31,2 ), интерлейкинов ИЛ-2 Р (15,9 ),(2,59 г/л),(2,48 г/л), ЦИК (99,2 оп. ед.) и снижении Т-лимфоцитов (51,3 ), СД 22(14,0 ). С учетом полученных данных выставлен заключительный клинический диагноз рассеянный склероз, цереброспинальная форма, прогредиентно-ремиттирующее течение, период обострения с высокой активностью ( стадия) демиелинизирующего процесса,степень тяжести (по двигательному дефекту). Пример 3. Больная М., 20 лет. Поступила в клинику неврологии 30 ноября 1994 г. с жалобами на выраженную слабость в ногах, из-за шаткости походки и головокружения не может ходить без посторонней помощи. Снижение зрения на оба глаза, недержание мочи. Из анамнеза известно, что больна около года, течение заболевания прогредиентное с нарастанием атаксии и слабости в ногах. При осмотре отмечено патологии со стороны внутренних органов нет. Пульс - 66 уд./мин, АД 125/80 мм рт. ст. Неврологически эйфория, горизонтальный нистагм в обе стороны, речь дизартрична. Глубокий спастический тетрапарез с патологическими рефлексами. Выраженная статическая и динамическая атаксия, ходит только с посторонней помощью. Анализы мочи и крови без патологии. На обзорных краниограммах патологии не выявлено. На ЯМР-томограммах головного мозга умеренное расширение борозд на конвексе, желудочки симметричные, слегка расширены, срединные структуры не смещены. В белом веществе ближе к конвексу и перивентрикулярно множественные мелкие (до 2 мм) очаги гипоинтенсивные в -1 и гиперинтенивные в -2 режимах. Заключение множественные легкие очаги демиелинизации. Глазное дно деколорация височных половин дисков зрительных нервов, концентрическое сужение полей зрения на цвета. Установлен клинический диагноз рассеянный склероз, цереброспинальная форма, прогредиентное течение, период обострения,степень тяжести (по двигательному дефекту). Для объективизации стадии активностиизучалась миелинотоксическая активность сыворотки крови МТЭ Она оказалась очень высокой. Среди иммунологических показателей было повышенным только содержание ЦИК (171 оп. ед.). С учетом полученных данных выставлен заключительный клинический диагноз рассеянный склероз, цереброспинальная форма, прогредиентное течение с очень высокой активностью ( стадия) демиелинизирующего процесса,степень тяжести (по двигательному дефекту). Пример 4. Больная Ш., 18 лет, обратилась в неврологический кабинет поликлиники с жалобами на чувство онемения в ногах, эпизоды (в течение нескольких дней) преходящего двоения. Считает себя больной в течение года, когда появилась легкая слабость в ногах, снижение зрения (0,6 на правый глаз и 0,7 - на левый). Все симптомы прошли без лечения в течение месяца. При осмотре патологии со стороны внутренних органов не выявлено. Пульс 78 уд. мин.,АД 115/60 мм рт. ст. Неврологически легкий горизонтальный нистагм при крайних отведениях глазных яблок. Диффузная мышечная гипотония. Сила в конечностях сохранена. Сухожильно-надкостничные рефлексы на ногах 3882 1 оживлены, без асимметрии, патологических - нет, брюшные - снижены. На руках сухожильно-надкостничные рефлексы живые, равновелики с обеих сторон. Координаторных нарушений нет. На краниограммах патологии нет. На ЯМР-томограммах полушария равновелики, борозды не расширены. Желудочки симметричны, срединные структуры не смещены. В белом веществе полушарий преимущественно перивентрикулярно - очаги демиелинизации (от 3 до 14 мм) ярко гиперинтенсивные в -2 и слабо гипоинтенсивные в -1 режимах. Заключение очаговые изменения можно трактовать как проявление демиелинизирующего заболевания. Глазное дно - легкая битемпоральная бледность дисков зрительных нервов. Установлен клинический диагноз рассеянный склероз, цереброспинальная форма, латентное течение. Для определения стадии активностиоценивались иммунологические показатели и миелинотоксическая активность сыворотки кровиоп 0,5473 МТЭ 100100112,3810012,4 усл. ед. 0,4870 Она оказалась слегка повышенной при снижении содержания в крови СД 4 (34 ), СД 8 (2 ) и повышении СД 22 (28 ), ЦИК (92 оп. ед.). С учетом полученных данных выставлен заключительный клинический диагноз рассеянный склероз, цереброспинальная форма, латентное течение с низкой активностью ( стадия) демиелинизирующего процесса. Пример 5. Больная ., 32 лет, обратилась в неврологический кабинет с жалобами на общую слабость, повышенную возбудимость, сниженный фон настроения, плохой сон, легкое пошатывание при ходьбе. Все вышеперечисленные жалобы появились после психотравмы. Указанные эпизоды имели место и раньше в течение последних двух лет (3 эпизода). При осмотре отмечено эмоционально лабильна, со стороны черепных нервов патологии не выявлено. Сила в конечностях сохранена, мышечный тонус не изменен. Сухожильные рефлексы оживлены, без асимметрии сторон, патологических рефлексов нет, брюшные рефлексы живые. В позе Ромберга тремор век и вытянутых пальцев рук, демонстративно делает попытку падения кзади. На краниограммах патологии не выявлено. Глазное дно без изменений. Установлен диагноз функциональное расстройство нервной системы с наличием истерических реакций. Для исключения дебюта рассеянного склероза, который может протекать с истерическими эпизодами, у больной исследованы показатели миелинотоксической активности сыворотки крови, которые оказались без отклонений от нормы (3,2 усл. ед.), и иммунологические показатели крови, которые также были без изменений. С учетом полученных данных заболеваниеисключается абсолютно. Таким образом, преимущество заявляемого способа заключается в возможности количественной оценки стадии активности демиелинизирующего процесса у больныхи за счет этого проведения наиболее адекватного лечения. Таблица 1 Миелинотоксическая активность сыворотки крови больных рассеянным склерозом и ее иммунологические показатели (маркеры) при латентном течении рассеянного склероза Контрольная группа, миелинотоксическая активность сыворотки крови 3,16-4,80 (усл. ед.) Т-а лимфоциты, , 60,84-63,46 Т-хелперы (СД 4), , 37,7-42,5 Т-супрессоры (СД 8), , 19,7-22,5 В-лимфоциты (СД 22), , 8,75-10,37 Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК),оп. ед., 55,04-73,60 Низкая миелинотоксическая активность сыворотки крови больных рассеянным склерозом (1 стадия) 6,4-8,8 (усл. ед.) 56,24-59,16 снижение 32,26-35,54 снижение 11,8-15,0 28,35-28,65 повышение 87,74-94,58 Таблица 2 Дифференциально-диагностические критерии миелинотоксической активности сыворотки крови ( истадии) у больных рассеянным склерозом и ее иммунологические показатели (маркеры) Контрольная группа Миелинотоксическая активность сыворотки крови Низкая миелинотоксическая активность сыворотки крови больных рассеянным склерозом ( стадия) Умеренно выраженная миелинотоксическая активность сыворотки крови ( стадия) Таблица 3 Дифференциально-диагностические критерии миелинотоксической активности сыворотки крови( истадии) у больных рассеянным склерозом и ее иммунологические показатели (маркеры) Умеренно выраженная миелино- Выраженная миелинотоксическая токсическая активность сыворотки активность сыворотки крови ( крови ( стадия) стадия) Контрольная группа Миелинотоксическая активность сыворотки крови (усл.ед.) 3,16-4,80 Т-хелперы (СД 4), , 37,7-42,5 Т-супрессоры (СД 8), , 19,7-22,5 Интерлейкины (ИЛ-2), ,10,9-12,7 Иммуноглобулины , г/л, 10,74-13,14 Иммуноглобулины А, г/л, 1,76-2,10 Иммуноглобулины М, г/л, 1,63-1,99 ЦИК (оп. ед.) 65,04-73,60 Таблица 4 Дифференциально-диагностические критерии миелинотоксической активности сыворотки крови( истадии) у больных рассеянным склерозом и ее иммунологические показатели (маркеры) Контрольная группа Миелинотоксическая активность сыворотки крови (усл. ед.) Т-супрессоры (СД 8), , 19,7-22,5 ЦИК (оп. ед.) 65,04-73,60 Выраженная миелинотоксическая активность сыворотки Очень высокая миелинотоксическая аккрови ( стадия) тивность сыворотки крови ( стадия) 38,9-41,3 27,19-32,01 91,55-97,75 Источники информации 1.2007714 1, 1994. 2. Петров , Хаитов , Пинетин Б.В. Оценка иммунного статуса человека в норме и патологии // Иммунология.1994. -6. - С. 6-9. 3. Филиппович Н.Ф. и др. Диагностические возможности метода количественной оценки продуктов распада миелина в крови // Достижения медицинской науки Беларуси. - Мн. - 1997. - . 2. - С. 131-132. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.