Способ прогнозирования развития рецидива рассеянного склероза

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ РЕЦИДИВА РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Нижегородова Дарья Борисовна Зафранская Марина Михайловна Федулов Александр Сергеевич(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(57) Способ прогнозирования развития рецидива рассеянного склероза, заключающийся в том, что выделяют из периферической венозной крови мононуклеары (МПК), удаляют из части МПК путем иммуномагнитной сепарации -лимфоциты, окрашивают интактные МПК и МПК с удаленной популяцией -лимфоцитов 5(6)-карбоксифлуоресцеином,культивируют в течение 10 дней в питательной среде, содержащей миелинспецифический протеин, окрашивают интактные МПК и МПК с удаленной популяцией-лимфоцитов меченными флуоресцентной меткой моноклональными антителами к 3 маркеру -клеток, регистрируют в обеих культурах количество поделившихся-клеток, определяют коэффициент пролиферации клетокв процентах по формуле П 100 МПК 100,П МПК где Пмпк- - количество поделившихся -клеток в культуре МПК с удаленной популяцией-лимфоцитов Пмпк - количество поделившихся -клеток в интактной культуре МПК,и при значениименее 40 прогнозируют развитие рецидива рассеянного склероза. Изобретение относится к медицине, к разделам нейроиммунологии, неврологии, аутоиммунной патологии и клеточной биологии. Проблема прогнозирования осложнений рассеянного склероза связана с отсутствием до настоящего времени лабораторных критериев оценки возможного развития рецидива заболевания. На сегодняшний день существует диагностический алгоритм обследования больных рассеянным склерозом (клиническая картина, офтальмологическое обследование, магнитно-резонансная томография), который позволяет идентифицировать рецидив рассеянного склероза, однако уже после его развития. 13874 1 2010.12.30 Задачей заявляемого способа является раннее прогнозирование возможного рецидива с целью назначения своевременного патогенетического лечения и предотвращения развития осложнений. Поставленная задача решается следующим образом. Предложен способ прогнозирования развития рецидива рассеянного склероза, заключающийся в том, что выделяют из периферической крови мононуклеары (МПК), удаляют из части МПК путем магнитной сепарации -лимфоциты, окрашивают интактные МПК и МПК с удаленной популяцией-лимфоцитов 5(6)-карбоксифлуоресцеином, культивируют в течение 10 дней в питательной среде, содержащей миелин-специфический протеин, окрашивают интактные МПК и МПК с удаленной популяцией -лимфоцитов меченными флуоресцентной меткой моноклональными антителами к 3 маркеру -клеток, регистрируют в обеих культурах количество поделившихся -клеток, определяют коэффициент пролиферации клетокв процентах по формуле П 100 мпк 100 ,П мпк где Пмпк- - количество поделившихся -клеток в культуре МПК с удаленной популяцией-лимфоцитов Пмпк - количество поделившихся -клеток в интактной культуре МПК,и при значениименее 40 прогнозируют развитие рецидива рассеянного склероза. Пример 1. Больной Н., 38 лет, поступил в отделение неврологии с диагнозом Рассеянный склероз, рецидивно-ремиттирующее течение. У больного был осуществлен забор периферической венозной крови, из которой методом центрифугирования на градиенте плотности в течение 30 мин с последующим отмыванием физиологическим раствором были выделены мононуклеары периферической крови (МПК). Суспензия МПК была разделена на 2 части из одной части МПК были удалены-лимфоциты методом иммуномагнитной сепарации с использованием набора моноклональных антител к -клеточному рецептору, а вторая часть МПК оставалась интактной. Для иммуномагнитной сепарации -клеток МПК, в концентрации 1107 МПК/мл, инкубировались с 10 мкл специфическими первичными моноклональными антителами в течение 10 мин, а затем с 10 мкл вторичными моноклональными антителами, несущие магнитные шарики в течение 10 мин. После инкубации пробирка с клетками помещалась в магнитный сепаратор на 10 мин, в результате чего меченная моноклональными антителами популяция -лимфоцитов оставалась в магнитном поле прибора, в то время как немеченые МПК, содержащие -лимфоциты, сливались в отдельную стерильную пробирку. Интактные МПК и МПК с удаленной популяцией -лимфоцитов в концентрации 1107 клеток/мл окрашивались внутриклеточным красителем карбоксифлуоресцеином(, 5-6-) в концентрации 7 в 1 мл культуральной среды -1640 в течение 5 мин в темноте при комнатной температуре. После остановки окрашивания путем отмывания МПК полной культуральной средой(-1640 с 25 мМ , 2 мМ -глютамина, 25 мкг/мл гентамицина, 10 инактивированной человеческой сывороткой группы ) клетки засевались в 96-луночный культуральный планшет в концентрации 2105 клеток/лунку и культивировались в течение 10 дней в присутствии 10 мкг/мл миелин-специфического протеина в увлажненной атмосфере с 52 при 37 С с заменой на 6-й день полной культуральной среды, содержащей 10 /мл интерлейкина-2. Регистрация миелин-специфической пролиферации -лимфоцитов в присутствии и отсутствии популяции -клеток осуществлялась на 10-й день культивирования методом проточной цитометрии. Для этого МПК и МПК с удаленной популяцией -лимфоцитов 2 13874 1 2010.12.30 окрашивались 3 мкл моноклональных антител к 3 маркеру -клеток, меченных флуоресцентной меткой, в течение 15 мин в темноте с последующей регистрацией количества поделившихся клеток. Результаты представлены в табл. 1. Таблица 1 Количество поделившихся 3 Т-клеток в ответ на миелин-специфический протеин у больного Н.поделившихся -клеток вподелившихся -клеток в суспензии МПК в присутствии суспензии МПК в отсутствие Согласно полученным данным, был подсчитан коэффициент пролиферации( ) по формуле П 100 мпк 100100(50,55100) / 52,774,21 П мпк Таким образом, коэффициент пролиферациисоставил менее 40, что позволяет прогнозировать возможное развитие рецидива рассеянного склероза. В связи с этим рекомендовано изменение схемы лечения и назначение курса иммуносупрессирующей патогенетической и/или кортикостероидной терапии. Пример 2. Больной К., 35 лет, поступил в отделение неврологии с диагнозом Рассеянный склероз, рецидивно-ремиттирующее течение. У больного был осуществлен забор периферической венозной крови, из которой методом центрифугирования на градиенте плотности в течение 30 мин с последующим отмыванием физиологическим раствором были выделены мононуклеары периферической крови (МПК). Суспензия МПК была разделена на 2 части из одной части МПК были удалены-лимфоциты методом иммуномагнитной сепарации с использованием набора моноклональных антител к -клеточному рецептору, а вторая часть МПК оставалась интактной. Для иммуномагнитной сепарации -клеток МПК, в концентрации 1107 МПК/мл, инкубировались с 10 мкл специфическими первичными моноклональными антителами в течение 10 мин, а затем с 10 мкл вторичными моноклональными антителами, несущие магнитные шарики в течение 10 мин. После инкубации пробирка с клетками помещалась в магнитный сепаратор на 10 мин, в результате чего меченая моноклональными антителами популяция -лимфоцитов оставалась в магнитном поле прибора, в то время как немеченые МПК, содержащие -лимфоциты, сливались в отдельную стерильную пробирку. Интактные МПК и МПК с удаленной популяцией -лимфоцитов в концентрации 1107 клеток/мл окрашивались внутриклеточным красителем карбоксифлуоресцеином(, 5-6-) в концентрации 7 в 1 мл культуральной среды -1640 в течение 5 мин в темноте при комнатной температуре. После остановки окрашивания путем отмывания МПК полной культуральной средой(-1640 с 25 мМ , 2 мМ -глютамина, 25 мкг/мл гентамицина, 10 инактивированной человеческой сывороткой группы ) клетки засевались в 96-луночный культуральный планшет в концентрации 2105 клеток/лунку и культивировались в течение 10 дней в присутствии 10 мкг/мл миелин-специфического протеина в увлажненной атмосфере с 52 при 37 С с заменой на 6-й день полной культуральной среды, содержащей 10 /мл интерлейкина-2. 3 13874 1 2010.12.30 Регистрация миелин-специфической пролиферации -лимфоцитов в присутствии и отсутствии популяции -клеток осуществлялась на 10-й день культивирования методом проточной цитометрии. Для этого МПК и МПК с удаленной популяцией -лимфоцитов окрашивались 3 мкл моноклональных антител к 3 маркеру -клеток, меченных флуоресцентной меткой, в течение 15 мин в темноте с последующей регистрацией количества поделившихся клеток. Результаты представлены в табл. 2. Таблица 2 Количество поделившихся 3 -клеток в ответ на миелин-специфический протеин у больного К.поделившихся -клеток вподелившихся -клеток в суспензии МПК в присутствии суспензии МПК в отсутствие -лимфоцитов (Пмпк) лимфоцитов (Пмпк-) Больной К. Согласно полученным данным, был подсчитан коэффициент пролиферации( ) по формуле П 100 мпк 100100(23,16100) / 38,7540,23 П мпк Таким образом, коэффициент пролиферациисоставил более 40, что позволяет прогнозировать отсутствие возможного развития рецидива рассеянного склероза. В связи с этим рекомендовано проводить поддерживающую терапию и не изменять схему лечения. Выводы. При определении коэффициента пролиферациименее 40 можно прогнозировать возможное развитие рецидива рассеянного склероза с целью назначения своевременного патогенетического лечения и предотвращения развития осложнений заболевания. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4