Способ определения содержания фикоцианина в нативной культуре спирулины

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФИКОЦИАНИНА В НАТИВНОЙ КУЛЬТУРЕ СПИРУЛИНЫ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Мельников Станислав Сергеевич Мананкина Елена Евгеньевна Самович Татьяна Викторовна Будакова Елена Анатольевна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ определения содержания фикоцианина в нативной культуре спирулины, заключающийся в том, что отбирают пробу нативной культуры спирулины, определяют ее оптическую плотность спектрофотометрически при длине волны 620 нм в диапазоне 1,03,0 и определяют содержание фикоцианина(мг/л) при коэффициенте корреляции ,равном 0,93, по формуле 77,8620 - 37,0,где 620 - оптическая плотность культуры при длине волны 620 нм. Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию хозяйственно-полезных видов микроорганизмов, а именно к способам определения количества отдельных ценных веществ биомассы, а конкретно фикоцианина спирулины. Сине-зеленая водоросль спирулина(.) . уже более 35 лет является объектом промышленной биотехнологии для получения биомассы,используемой для лечения и профилактики болезней, в качестве витаминно-кормовой добавки к рационам кормления сельскохозяйственных животных, для промышленного получения из нее различных ценных веществ - -каротина, фикоцианина, полиненасыщенных жирных кислот. Мировое производство сухой биомассы спирулины достигло в 2004 году 8000 т, а объем продаж составил 158 млн. долларов США. Количество крупных ферм, занимающихся выращиванием спирулины, превысило 300 и продолжает быстро увеличиваться. Спирулину выращивают во всех сопредельных Беларуси странах. Биомасса водорослей содержит 70 высококачественного белка, более 14 витаминов,много полиненасыщенных жирных кислот и других ценных соединений. Одним из них является фикоцианин - синий пигмент фикобилиновой природы, принимающий активное 14098 1 2011.02.28 участие в процессе фотосинтеза. Это сложноорганизованный глобулярный белок с молекулярной массой 264 кДа. По антиоксидантной активности превосходит аскорбиновую кислоту в 20 раз, а тролокс в 16 раз. Установлено, что его антиоксидантные свойства выше, чем у -токоферола, зеаксантина и кофейной кислоты. Фикоцианин стимулирует иммунную систему, перспективен при лечении болезней печени, канцерогенных заболеваний и СПИДа, имеет высокую радиопротекторную активность (выводит из организма 137 и 90), используется при фотодинамической терапии опухолей у людей. Это свидетельствует, что фикоцианин является наиболее ценным веществом биомассы спирулины и при ее выращивании с целью получения этого соединения, особенно с использованием стимуляторов биосинтеза фикоцианина, возникает необходимость постоянного контроля содержания фикоцианина в биомассе. Известен способ получения белкового препарата из сухой биомассы спирулины 1. Способ включает водную экстракцию, фракционную преципитацию сернокислым аммонием концентрацией от 20 до 70 от насыщения, по завершении каждой стадии проводят центрифугирование с отделением белкового осадка, обработку которого далее осуществляют на диэтиламиноэтиловом активированном носителе методом ионообменной хроматографии с последующими обработкой на мембранной установке до содержания солей 5 и сушкой готового продукта до влажности не более 3 . Хроматография на ДЭАЭ сефацеле и хроматография на суперозе-12 приводят к потере большей части пигмента. Данный способ позволяет получить высокоочищенный препарат фикоцианина. Недостатками данного способа являются многостадийность, большой расход реактивов и времени на выделение фикоцианина, большие потери его во время выделения (более 80 ). Все остальные известные способы определения фикоцианина связаны с экстракцией пигмента натрий-фосфатным буфером ( 7,0) с трилоном Б после предварительного осаждения и разрушения клеток, спектрофотометрированием и расчетом количества фикоцианина по формуле(615 - 0,474652)/5,34, где- оптическая плотность суспензии клеток при данной длине волны 2. Все эти способы не могут быть применены при массовых анализах содержания фикоцианина в биомассе спирулины. Так, например,исследование влияния всего лишь 3 различных веществ при 4 концентрациях каждого из них на накопление фикоцианина клетками спирулины приведет при 3-кратной биологической повторности к необходимости определить содержание фикоцианина, учитывая контроль, в 39 пробах. Легко представить, насколько это трудоемкая задача и как велик будет расход реактивов и электроэнергии (центрифугирование) при использовании существующих способов определения фикоцианина. Информации, касающейся определения содержания фикоцианина в нативной культуре спирулины, не найдено. Задачей изобретения является создание дешевого и простого способа определения содержания фикоцианина в нативной культуре спирулины (без разрушения клеток), что позволит расширить арсенал способов определения. Задача решается следующим образом. Способ определения содержания фикоцианина в нативной культуре спирулины заключается в следующем. Сначала отбирают пробу нативной культуры спирулины и определяют ее оптическую плотность спектрофотометрически при длине волны 620 нм в диапазоне 1,0-3,0. А затем определяют содержание фикоцианина(мг/л) при коэффициенте корреляции , равном 0,93, по формуле 77,8620 - 37,0,где 620 - оптическая плотность культуры при длине волны 620 нм. Способ определения содержания фикоцианина в нативной культуре спирулины осуществляется следующим образом пробу нативной культуры спирулины помещают в кювету для спектрофотометрирования и на спектрофотометре или колориметре-нефелометре определяют оптическую плотность при длине волны 620 нм, длине оптического пути 1 см 2 14098 1 2011.02.28 в максимуме поглощения фикоцианина и в диапазоне оптической плотности в пределах 1,0-3,0, затем содержание фикоцианина (, мг/л) при коэффициенте корреляции 0,93 определяют по формуле 77,8620 - 37,0,где 77,8 и 37,0 - коэффициенты, полученные расчетным путем, мг/л 620 - оптическая плотность культуры при длине волны 620 нм. При разработке данного способа использовали особенности пигментного состава, а следовательно, и спектра поглощения нативной культуры водоросли. На фиг. 1 представлен спектр поглощения нативной культуры водоросли. Спирулина содержит хлорофилл(максимумы в спектре поглощения 438 и 678 нм), каротиноиды (плечо в области 490 нм) и фикоцианин, имеющий хорошо разрешенный максимум в области 620 нм. Поглощение,обусловленное иными пигментами в этой области спектра, отсутствует, и величина максимума при 620 нм пропорциональна количеству фикоцианина, находящегося в клетках спирулины. Штамм(.) . -59 был получен из коллекции сине-зеленых водорослей МГУ. Водоросль выращивали в конических колбах на 250 мл (объем суспензии 150 мл) на модифицированной среде для выращивания спирулины (патент 9416 1 2007.06.30) следующего состава (г/л) твердые шламоотходы ПО Беларуськалий - 10 пищевая сода (3) - 12 натриевая селитра (3) - 2,5 аммофос (424) - 0,3 ацетат натрия (3) - 0,3 цитрат железа (6572) 11,7 мг/л раствор микроэлементов по Упитису - 1 мл. Культуру освещали светом люминесцентных ламп 40/32-765 интенсивностью 26 Вт/м 2 с режимом 14 ч света - 10 ч темноты в течение суток, температура 26 С. Засев культуры проводили таким образом,чтобы начальная оптическая плотность суспензии при 750 нм была 0,22, что эквивалентно содержанию 211 г абсолютно сухого вещества (АСВ) в 1 л культуры. Количество сухого вещества в суспензии (г/л) рассчитывали по формуле 3(7500,08)/1,42, где 750 - оптическая плотность суспензии, измеренная на спектрофотометре марки 830. При меньших количествах посевной биомассы культура дольше адаптируется к новой среде и медленнее развивается. На 10-й день культивирования, определив оптическую плотность суспензии спирулины при 750 и 620 нм, клетки осаждали центрифугированием, промывали дистиллированной водой и растирали в ступке (без песка) в -фосфатном буфере (50 мМ,7,0). Полученную суспензию оставляли в холодильнике на три часа, затем центрифугировали 3 мин при 13000 об/мин ( ). Полученный экстракт спектрофотометрировали на спектрофотометре ( 931) при 615 и 652 нм и рассчитывали содержание фикоцианина по формуле 2(615 - 0,474652)/5,34. На основании измерений величин оптической плотности (620) спектров поглощения 75 различных нативных культур спирулины разного возраста (от 10 до 14 суток) и одновременного определения соответствующих этим величинам количеств фикоцианина, с помощью математической (статистической) обработки зоны измерений оптических плотностей культуры спирулины от 1,0 до 3,0 и количества фикоцианина в биомассе этой культуры, получили уравнение аппроксимационной прямой вида 77,8620 - 37,0,при значении коэффициента корреляции 0,93,где- содержание фикоцианина в мг в 1 л культуры спирулины,77,8 и 37,0 - коэффициенты, полученные расчетным путем,620 - оптическая плотность культуры при длине волны 620 нм. На фиг. 2 представлена аппроксимационная прямая зависимости содержания фикоцианина в нативной культуре спирулины от 620 (в интервале значений 1,0-3,0). Пример Берут 1-3 мл суспензии спирулины, помещают в кювету для спектрофотометрирования и на спектрофотометре (колориметре-нефелометре) определяют оптическую плот 3 14098 1 2011.02.28 ность при длине волны 620 нм в максимуме поглощения фикоцианина. Используя формулу 77,8620 - 37,0,определяем содержание фикоцианина в нативной культуре (мг/л). Например при значении 6201,5 получим значение(77,81,5 - 37,0)79,7 (мг/л). Умножив полученную величину на объем суспензии в литрах, получим значение количества фикоцианина в имеющемся объеме суспензии спирулины. Таким образом, предлагаемый способ определения содержания фикоцианина в культуре спирулины позволяет проводить массовые анализы содержания фикоцианина в клетках нативной культуры спирулины, значительно сократить время проведения анализа и расходы на реактивы. Источники информации 1. Патент РФ 2320195, МПК 23 3/20, опубл. 27.03.2008. 2.Т., - //. - 2000. - . 26,4. - . 607-619. 3. Налимова А.А., Попова В.В., Цоглин Л.Н., Пронина Н.А. Влияние меди и цинка на рости аккумуляция клетками тяжелых металлов // Физиология растений. - 2005. - Т. 52. - С. 259-265. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4