Способ получения препарата для иммунокоррекции

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ИММУНОКОРРЕКЦИИ(71) Заявители Зайцева Алеся Владимировна Зайцева Виктория Владимировна Дремач Геннадий Эдуардович Зайцева Людмила Петровна(72) Авторы Зайцева Алеся Владимировна Зайцева Виктория Владимировна Дремач Геннадий Эдуардович Зайцева Людмила Петровна(73) Патентообладатели Зайцева Алеся Владимировна Зайцева Виктория Владимировна Дремач Геннадий Эдуардович Зайцева Людмила Петровна(56)7787 1, 2006.11671 1, 2009. ЗАЙЦЕВА А.В. и др. Сельское хозяйство - проблемы и перспективы. Тезисы международной научно-практической студенческой конференции. - Гродно,2005. - . 191-192.57-14533 , 1982.63201 , 2004.2051969 1, 1996.2112531 1, 1998.4076807, 1978. ДРЕМАЧ Г.Э. и др. Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия аграрных наук. - 2005. -2. - С. 92-94.594173, 1978.(57) Способ получения препарата для иммунокоррекции, включающий обработку бактериальной массы, ее отделение, выделение липополисахаридпептидной фракции соматического антигена путем экстракции бактериальной массы 0,5-1,0 -ным раствором аммиака в течение 60-100 минут, отделение экстракта и консервацию, отличающийся тем, что используют бактериальную массу сальмонелл или эшерихий, которую предварительно инактивируют в присутствии 0,1-0,3 формалина, затем обрабатывают 0,5-1,0 -ным раствором аммиака при температуре 50-75 С, а экстракцию осуществляют при температуре 90-120 С. Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии, а именно к способу получения иммуностимулятора из соматических антигенов сальмонелл или эшерихий. Широко известны способы получения иммуностимулирующих препаратов из экстрактов бактериальных клеток 1-8 детоксицированный липополисахарид из нейсерий 3 липополисахарид из биомассы авирулентного штамма .выделяют водно-фенольной экстракцией при температуре 65 С по способу ., . 8 и очищают гельфильтрацией на сефадексе 200 4 липополисахарид получают путем экстракции бактерий трихлоруксусной кислотой 5 липополисахарид из биомассы .штамма 475 выделяют по методу.7 и очищают путем трехкратного пересаждения и дальнейшего центрифугирования при 15000 д в течение двух часов 6 14028 1 2011.02.28 липополисахарид из биомассы пуллорных бактерийштамма 24 КСТ выделяют путем экстракции биомассы бактерий 0,5 -ным раствором аммиака при температуре 80 С в течение 60 мин и последующей обработки экстракта формалинизированными эритроцитами в соотношении 11 1 полисахарид антиген из биомассы сальмонелл, обработанных ацетоном в течение 2460 ч при температуре 4-20 С и массовом соотношении 13, экстрагируют 0,5-1,0 -ным раствором аммиака в течение 60-100 мин при температуре 90-105 С, центрифугируют и в центрифугат добавляют до 0,5-1,0 тиосульфата натрия 2 и другие. Наиболее близким техническим решением к предлагаемому изобретению является способ получения биологически активного препарата из сальмонелла тифи 3. Этот препарат представляет собой полисахаридную фракцию соматического -антигена бактерий брюшного тифа, который получают путем депротеинизации фенольного антигена с последующим удалением липидапри гидролизе в ацетоне. Однако препарат, полученный из биомассы сальмонелла тифи, обладает высокой токсичностью и низкой биологической активностью. Задача изобретения - увеличение биологической активности целевого продукта и снижение его токсичности. Поставленная цель достигается тем, что биомассу сальмонелл или эшерихий инактивируют формалином, балластные компоненты элюируют с поверхности бактериальных клеток 0,5-1,0 -ным раствором аммиака при температуре 50-75 С, а липополисахаридпептидную фракцию соматических антигенов экстрагируют 0,5-1,0 -ным раствором аммиака. Сущность изобретения. Способ получения препарата для иммунокоррекции, включающий обработку бактериальной массы, ее отделение, выделение липополисахаридпептидной фракции соматического антигена путем экстракции бактериальной массы 0,51,0 -ным раствором аммиака в течение 60-100 мин, отделение экстракта и консервацию,отличающийся тем, что используют бактериальную массу сальмонелл или эшерихий, которую предварительно инактивируют в присутствии 0,1-0,3 формалина, обрабатывают 0,5-1,0 -ным раствором аммиака при температуре 50-75 С, а экстракцию осуществляют при температуре 90-120 С. Пример 1. Сальмонеллезные бактерии выращивали на питательной среде, инактивировали путем добавления до 0,3 формалина и обрабатывали 1,0 -ным раствором аммиака при температуре 75 С, биомассу бактерий отделяли от культуральной жидкости путем центрифугирования. Биомассу ресуспендировали в 1,0 -ном растворе аммиака и инкубировали при температуре 120 С в течение 100 мин. Полученный экстракт отделяли от бакмассы центрифугированием и консервировали добавлением до 0,1 формалина. Белым мышам вводили препарат подкожно двукратно в дозе 0,06 см 3/гол. и инфицировали в дозе 2 50 рожистыми бактериями штамма матрикса Конева. Контрольным животным препарат не вводили. Через 7 суток в контрольной группе погибли все животные, а в опытной сохранность составила 100 . Пример 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но использовали эшерихиозные бактерии, а экстракт консервировали добавлением до 0,3 формалина. Введение препарата обеспечивало сохранность 90,0 животных, инфицированных рожистыми бактериями. Пример 3. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но сальмонеллезные бактерии инактивировали путем добавления до 0,1 формалина и обрабатывали 0,5 -ным раствором ам 2 14028 1 2011.02.28 миака при температуре 50 С, биомассу бактерий отделяли от культуральной жидкости путем центрифугирования. Биомассу ресуспендировали в 0,05 -ном растворе аммиака и инкубировали при температуре 90 С в течение 100 мин. Приготовленный препарат защищал от гибели 100 инфицированных мышей. Пример 4. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но биомассу сальмонелл инактивировали путем добавления формалина до 0,05 . Препарат защищал от гибели 70 инфицированных мышей. Пример 5. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но биомассу сальмонелл инактивировали путем добавления формалина до 0,4 . Препарат защищал от гибели 60 инфицированных мышей. Пример 6. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но инактивированную бакмассу обрабатывали 0,4 -ным раствором аммиака при температуре 45 С. Приготовленный препарат защищал от гибели 70 инфицированных животных. Пример 7. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но инактивированную бакмассу обрабатывали 1,1 -ным раствором аммиака при температуре 80 С. Препарат защищал от гибели только 40 инфицированных животных. Пример 8. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но инактивированную бакмассу экстрагировали 0,4 -ным раствором аммиака при температуре 85 С в течение 55 мин. Полученный препарат защищал от гибели 40 инфицированных животных. Пример 9. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но инактивированную бакмассу экстрагировали 1,1 -ным раствором аммиака при температуре 123 С в течение 105 мин. Полученный препарат защищал от гибели 60 инфицированных животных. Пример 10. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но экстракт не отделяли от бакмассы центрифугированием и не консервировали формалином. Полученный препарат был токсичным и вызывал гибель 100 белых мышей опытной и контрольной групп. Из представленных данных следует, что предварительная инактивация бакмассы формалином в концентрации ниже 0,1 и выше 0,3 приводит к снижению активности целевого продукта. Предварительная обработка инактивированной бакмассы аммиаком при температуре ниже 50 С и выше 75 С при концентрациях аммиака 0,4 и 1,1 способствовала снижению биологической активности целевого продукта. При инкубации бакмассы в 1,1 -ном растворе и при температуре выше 120 С отмечается разрушение (деградация) антигенного комплекса бактерий и соответственно снижается активность целевого продукта. Экстракция соматических антигенов в присутствии 0,4 -ного раствора аммиака и при температуре 85 С в течение 55 мин не обеспечивает полной элюции указанных антигенов с поверхности бактериальных клеток и, как следствие этого, наблюдается снижение активности целевого продукта. Препарат, изготовленный при оптимальных параметрах, обеспечивает защиту от гибели 90-100 инфицированных животных. 14028 1 2011.02.28 Источники информации 1. Патент РБ 4371. 2.7787 1, 2006. 3. Дельвич А.А. и др. Протективная активность детоксицированного липополисахаридасерогруппыв опытах// Микробиология. - 1989. -5. - С. 70. 4. Татаренко Т.М., Дальвадяну С.М., Бахрах Е.Э. Проблемы особоопасных инфекций. Саратов, 1972. Вып. 3 (25). - С. 93-98. 5..,. // . . - 1993. - . 144. - . 307-310. 6..,.,.. // . . . 1985. - . 151. . 399-404. 7. // . . . - 1965. - . 5. - . 92-95. 8..,. // . . . - 1965. - . 5. - . 83-91. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4