Способ подавления репродукции вируса гриппа в культуре клеток

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ГРИППА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии и микробиологии(72) Авторы Бореко Евгений Иванович Савинова Ольга ВладимировнаПавлова Наталья ИльиничнаКазакова Оксана Борисовна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии(57) Способ подавления репродукции вируса гриппа в культуре клеток, отличающийся тем, что на монослой инфицированных вирусом клеток наносят разведенные в среде 199 ремантадин в концентрации до 12,5 мкг/мл и 3-оксим бетулоновой кислоты в концентрации до 100 мкг/мл. Изобретение относится к области медицины, в частности вирусологии, и может быть использовано для подавления размножения вирусов гриппа и редукции вызываемых ими заболеваний. Известен способ подавления репродукции вируса гриппа с использованием 3-оксима бетулоновой кислоты 1. Недостатком способа является относительно невысокая противовирусная активность. Более интенсивное снижение репродукции вируса гриппа может быть достигнуто с использованием ремантадина 2-4. Недостатком такого способа ингибирования вируса в отдельных случаях также является сниженная активность 4. Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, обладающих противовирусным действием. Поставленная задача достигается в способе подавления репродукции вируса гриппа в культуре клеток. На монослой инфицированных вирусом клеток наносят разведенные в среде 199 ремантадин в концентрации до 12,5 мкг/мл и 3-оксим бетулоновой кислоты в концентрации до 100 мкг/мл. 13282 1 2010.06.30 Авторами обнаружено неочевидное свойство, позволяющее применить 3-оксим бетулоновой кислоты и ремантадин для увеличения противовирусного действия. Сущность изобретения иллюстрируется примерами. Пример 1. Токсическое действие 3-оксима бетулоновой кислоты для культуры клеток. Токсические свойства определяют по способности вызывать цитодеструктивные изменения клеток спустя 72 ч инкубации. Монослойные культуры клеток первичнотрипсинизированных фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) отмывают от ростовой среды и наносят разведения 3-оксима бетулоновой кислоты на среде поддержки (среда 199) с концентрацией 800 мкг/мл и менее. 3-Оксим бетулоновой кислоты предварительно растворяют в 10 этаноле (маточный раствор). По истечении указанного срока неокрашенные культуры просматривают при малом увеличении микроскопа (объектив 10). Максимальной переносимой концентрацией (МПК) принимают наивысшую концентрацию вещества,не вызывающую указанных изменений. Устанавливают, что в диапазоне концентраций от 400 мкг/мл и более низких 3-оксим бетулоновой кислоты не обладает способностью вызывать цитодеструкцию клеток. Пример 2. Токсическое действие ремантадина для культуры клеток. Исследование, описанное в примере 1, выполняют с ремантадином. Устанавливают,что в диапазоне концентраций от 12,5 мкг/мл и более низких ремантадин не обладает способностью вызывать цитодеструкцию клеток. Пример 3. Противовирусное действие 3-оксим бетулоновой кислоты. Исследование проводят методом редукции количества бляшек под агаровым покрытием. Монослойную культуру ФЭК, выращенную во флаконах, отмывают от ростовой среды, инфицируют различными разведениями вируса гриппа //34 (71) в пределах 0,01-0,00001 БОЕ/клетка путем нанесения вируссодержащей суспензии в объеме 0,1 мл на 1 ч при 37 С. Затем жидкость удаляют и клетки покрывают расплавом питательного покрытия на основе концентрата среды 199 с добавлением 1 бактагара и 0,005 нейтрального красного (все реактивы ) и различных концентраций исследуемого соединения. 3-Оксим бетулоновой кислоты предварительно растворяют в 10 этаноле (маточный раствор). После застывания покрытия флаконы помещают в термостат на 36 ч и затем подсчитывают количество бляшек, видимых благодаря присутствию в покрытии витального красителя. На основе количества бляшек вычисляют титр вируса. Критерием противовирусного действия считают наличие различий в сравнении с контролем вируса. Вычисляют также концентрацию 50 подавления размножения вируса (среднеэффективная концентрация,ЕС 50) и отношение МПК к 50. Полученные результаты приведены в таблице. 50 3-оксим бетулоновой кислоты составляет 4,9 (6,53,6) мкг/мл, отношение МПК/50 - 82. Пример 4. Противовирусное действие ремантадина. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с ремантадином. Полученные результаты приведены в таблице. 50 ремантадина составляет 0,003 (0,010,0009) мкг/мл, отношение МПК/504 167. Пример 5. Противовирусное действие 3-оксим бетулоновой кислоты и ремантадина при совместном использовании. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с различными концентрациями 3-оксим бетулоновой кислоты и 0,1 мкг/мл ремантадина. Полученные результаты приведены в таблице. ЕС 50 3-оксим бетулоновой кислоты в присутствии ремантадина составляет 1,1 (1,50,9) мкг/мл, отношение МПК/50 - 364. 13282 1 2010.06.30 Пример 6. Противовирусноедействие ремантадина и 3-оксим бетулоновой кислоты при совместном использовании. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с различными концентрациями ремантадина и 3,0 мкг/мл 3-оксим бетулоновой кислоты. Полученные результаты приведены в таблице. 50 ремантадина в присутствии 3-оксим бетулоновой кислоты составляет 0,0015 (0,0030,0008) мкг/мл, отношение МПК/50 - 8 333. Подавление репродукции вируса гриппа в культуре клеток ФЭК в присутствии 3-оксим бетулоновой кислоты , ремантадинаи их сочетаний Титр Разность с конШифр Концентрация,50(95),вируса,тролем,МПК/50 вещества мкг/мл мкг/мл БОЕ/мл БОЕ/мл 100 4,0 2,35 50 4,0 2,35 25 5,060,05 1,29 4,9 13282 1 2010.06.30 Таким образом, заявляемое решение позволяет решить поставленную задачу. При совместном использовании 3-оксим бетулоновой кислоты и ремантадина удается получить увеличение ингибирования репродукции вируса гриппа в культуре клеток в сравнении с индивидуальным применением веществ. При оценке по среднеэффективной концентрации или по отношению МПК/50 активность 3-оксим бетулоновой кислоты увеличивается в 4,4 раза, ремантадина - в 2 раза. Значение фракционального индекса ингибирования(ФИИ), рассчитанное по формуле ФИИ 50 в-ва А в комбинации/50 в-ва А в отдельности 50 в-ва Б в комбинации/50 в-ва Б в отдельности 5, составляет 0,72. Оно свидетельствует о синергизме комбинированного использования препаратов. Заявляемое решение может быть непосредственно в настоящий момент использовано в исследовательской лабораторной практике для подавления репродукции вируса гриппа и редукции вызываемых им заболеваний. Информационные источники 1. Патент РБ 7811, С 07 53/00, 63/00, А 61 Р 31/16, 2003. 2. Патент США 3,352,912, МПК 07 295/0007 295/0307 49/0007 49/323. 3. Патент США 3,592,934, МПК 07 295/0307 295/00. 4. Бореко Е.И., Павлова Н.И. Амантадин и ремантадин в профилактике и лечении гриппа // Медицинские новости. - 1999. -3(47). - С. 20-25. 5.С.,.// . .- 1982. - . 73. - . 135-143. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4